細(xì)胞學(xué)診斷檢材的制備技術(shù)一、細(xì)胞涂片、組織印片和壓片的制備（一）涂片質(zhì)量的基本要求1.將檢材涂布于載玻片的右（或左）2/3處，另1/3部位粘貼標(biāo)簽。2.單向涂布檢材，避免細(xì)胞變形。3.均勻涂布檢材，涂片厚薄適當(dāng)。4.紅細(xì)胞過多的涂片，可酌情進(jìn)行溶解紅細(xì)胞處理。（二）涂片方法1.涂抹法：用棉簽或針頭將標(biāo)本單向、均勻地涂抹于載玻片上。2.拉片法：將一滴檢材置于一張載玻片上，再用另一張載玻片疊加其上并予輕壓，再將該兩張載玻片朝反向拉動，從而獲得兩張涂片。3.推片法：將一滴檢液置于載玻片的右端，再用另一張窄邊光滑的載玻片作為推片，并以與滴液載玻片成40°夾角、自右向左勻力推動檢液，形成涂片。（三）痰涂片的制作1.送檢的痰液應(yīng)是由肺內(nèi)咳出，最好是清晨空腹時(shí)自肺內(nèi)深咳出的痰液。2.核查無誤的收驗(yàn)痰液，應(yīng)立即制作涂片（通常為2～3張）。3.用細(xì)簽或無鉤鑷子挑取痰液置于載玻片上，并左右往復(fù)薄涂，隨即投入固定液中。4.痰液中呈現(xiàn)下列性狀的成分可能含有癌細(xì)胞，應(yīng)注意挑取制作涂片：①血絲；②灰白色痰絲（形如白色細(xì)線，微細(xì)螺旋狀，牽引時(shí)可伸長）;③透明痰液（可拉成較長細(xì)絲）。[及時(shí)在細(xì)胞學(xué)檢查申請單上記錄痰液性狀]5.檢查痰液中的腫瘤細(xì)胞，一般應(yīng)連續(xù)送檢3次。（四）黏膜、皮膚表面刮取（刷取、拉取）物和分泌物的涂片的制作1.陰道排出物、子宮頸刮取物涂片：通常由婦產(chǎn)科醫(yī)師將已制作、固定后的涂片送交病理科檢查。[注意由子宮頸外口上皮移行帶刮取細(xì)胞涂片]2.支氣管鏡、胃鏡等內(nèi)腔鏡的黏膜刷取物涂片（黏膜刷片）：刷片通常由內(nèi)腔鏡醫(yī)師制作、固定后送交病理科檢查。3.食管、胃拉網(wǎng)涂片：由食管拉出的套網(wǎng)氣囊適量放氣后，將氣囊套網(wǎng)在載玻片滾動涂片，尤應(yīng)將套囊上血絲、灰白色物制作涂片；涂片通常由有關(guān)臨床醫(yī)師將已制作、固定后的涂片送交病理科檢查。套網(wǎng)中的小塊組織可用來制作石蠟包埋切片。4.眼、耳、鼻、咽、口腔、皮膚等處病變（潰瘍性病變等）的分泌物涂片。（五）液體涂片的制作液體標(biāo)本（檢材）包括乳頭溢液、胸腔積液、腹水、尿液、胃液、腦脊液、穿刺液、沖洗液、灌注液等。除乳頭溢液外，其他液體檢材一般均應(yīng)先行離心（2000r/min，10～20min）后，取其沉淀物制作涂片；液體檢材也可用細(xì)胞涂片離心機(jī)（cytospin）直接制作細(xì)胞涂片。制作好的涂片應(yīng)立即固定和染色。[及時(shí)在細(xì)胞學(xué)檢查申請單上記錄液體標(biāo)本的性狀和數(shù)量]液體標(biāo)本的離心沉淀物較多時(shí)，將制作涂片后剩余的沉淀物固定于4%中性甲醛中1h，然后用擦鏡紙或綢布將其包裹，制作石蠟包埋切片。1.乳頭溢液：直接滴于載玻片上制作涂片。（1）患者乳腺觸及腫物時(shí)：用手指自腫物遠(yuǎn)方沿乳腺導(dǎo)管引流方向輕力按模擠壓，獲取溢液，宜取中段溢液和血性溢液涂片。（2）患者乳腺未觸及腫物時(shí)：可自乳暈周圍向乳腺外周輕力按摩擠壓，獲取溢液。2.胸水和腹水（1）由患者體內(nèi)抽取的胸腔積液或腹水應(yīng)盡快送交病理科驗(yàn)收，檢液量以200～500ml為宜。因故（例如遠(yuǎn)途）延時(shí)送達(dá)時(shí)，需在標(biāo)本中加入40%的甲醛（加入量為送檢胸腔積液、腹水量的1/5），或加入等量的50%乙醇－生理鹽水。（2）胸腔積液、腹水的離心：采取容器底部的液體10ml（包括可能存在的沉淀物），移入離心管內(nèi)進(jìn)行離心。（3）離心后，傾去全部上清液，將離心管底部含有沉淀物的液體搖勻并用吸管吸出適量，滴注于載玻片上，制作涂片。3.尿液（1）制作方法同胞、腹水。（2）尿液含有膠狀物時(shí)，應(yīng)先將其除去。清除方法：用0.5ml/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)尿液Ph至6.0；離心后，傾去上清液，再向沉淀物中加入95%乙醇5～10ml/L（固定細(xì)胞），靜置5min后加入蒸餾水并輕搖（溶去膠狀物）；再次離心后，取沉淀物制作涂片。檢查尿液中的腫瘤細(xì)胞，一般應(yīng)連續(xù)送檢3次。4.胃液、胃沖洗液：制作方法同胞、腹水。5.腦脊液（1）制作方法同胞、腹水。（2）腦脊液內(nèi)細(xì)胞一般較少，可用微孔濾膜過濾法、沉淀法或纖維捕捉法收集細(xì)胞，制作涂片。6.沖洗液、灌洗液、穿刺液涂片的制作：參見上述的胸腔積液、腹水項(xiàng)。二、腫物細(xì)針穿刺物涂片的制備（一）實(shí)施細(xì)則針穿刺術(shù)前的準(zhǔn)備工作1.實(shí)施細(xì)則針穿刺術(shù)的病理醫(yī)師應(yīng)先了解患者臨床情況，向患者和/或患者授權(quán)人說明實(shí)施穿刺術(shù)的意義、局限性和其他相關(guān)問題等，取得患者和/或患方的知情和理解，并簽署由各醫(yī)院制訂的《申請實(shí)施細(xì)針穿刺術(shù)細(xì)胞病理學(xué)診斷患方知情同意書》。2.合格的手術(shù)操作環(huán)境。3.必備的適用手術(shù)器械和其他相關(guān)設(shè)施。（二）腫物穿刺術(shù)的操作要點(diǎn)：1.確認(rèn)腫物部位并估計(jì)其大小、與皮表距離和質(zhì)地（實(shí)/囊性、硬度等），以指導(dǎo)穿刺的方向、深度和用力程度。2.必須嚴(yán)格實(shí)行無菌操作。3.根據(jù)腫物大小及其血供情況選擇適用型號的穿刺用針頭。穿刺用針頭的外徑為0.6～0.9mm，安置在2ml或10ml的一次性空注射器上。4.針吸法穿刺術(shù)操作要點(diǎn)（1）進(jìn)行穿刺前，先將安裝了穿刺用針頭的空注射器管芯外拉2cm；然后，用手固定腫物，將安裝在空注射器上的穿刺用針頭刺入腫物（注射器內(nèi)無空氣）。（2）迅速上下提插注射器管芯10～20次（其間變換針頭方向3～4次），遂使腫物不同部位的多余內(nèi)容吸進(jìn)入針頭和注射器內(nèi)。（3）將注射器與針頭分離（管內(nèi)負(fù)壓因而解除）；隨后，再將該注射器與仍插于腫物內(nèi)的針頭相接，拔出針頭，穿刺結(jié)束。（4）迅速推動注射器的管芯，盡快地將位于穿刺針頭內(nèi)的少量吸出物排射在2～3張清潔的載玻片上，進(jìn)行涂片。5.涂片方法：用針頭將載玻片上的吸出物輕輕均勻撥開，或用推片法朝一個(gè)方向展開（不可雙向往返推移）。6.吸出物過少時(shí)，可用向離心管內(nèi)沖洗穿刺針頭；再將沖洗液離心，然后取其沉淀物涂片[參見上述一（五）項(xiàng)“液體涂片的制作”]。7.吸出物較多時(shí)，可適量50%乙醇-生理鹽水液將涂片后注射器和針頭內(nèi)剩余的吸出物沖洗至離心管中，離心后，取其沉淀物制作常規(guī)石蠟包埋切片。8.吸出物中含有細(xì)小組織塊時(shí)，應(yīng)將其制作常規(guī)石蠟包埋切片。9.內(nèi)臟腫物穿刺時(shí)，必須在影像學(xué)檢查的引導(dǎo)下用較長細(xì)針進(jìn)行穿刺。10.穿刺操作完成后，即在細(xì)胞病理學(xué)檢查單上書寫穿刺記錄。三、組織印片、壓片的制備（一）組織印片：1.用鋒利刀片剖開剛切取的新鮮腫瘤組織或淋巴結(jié)等，然后用清潔載玻片輕壓于組織剖面處，將組織表面的細(xì)胞成分印在玻片上。用稍微加溫的載玻片制備印片時(shí)，可印得較多細(xì)胞。2.制作淋巴結(jié)印片前，應(yīng)先用濾紙吸去淋巴結(jié)切面上的血液、組織液。（二）壓片：1.選取微小薄片組織平鋪于一張載玻片上，再用另一張載玻片疊加其上并予輕壓。2.腦組織質(zhì)軟，易于制作壓片；稍硬的組織需切成細(xì)碎薄片制作壓片。四、涂片的固定（一）用于蘇木精-伊紅染色和巴氏染色的涂片必須濕固定，即涂片后立即進(jìn)行固定。乳頭溢液涂片和液體標(biāo)本離心沉淀物涂片，應(yīng)待涂膜潮干（即周膜稍干而其中央?yún)^(qū)域未干）時(shí)進(jìn)行固定。用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆薩染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色的涂片，必須干固定，即待涂片稍干后再進(jìn)行固定。（二）固定液1.乙醇-冰醋酸液：95%乙醇∶冰醋酸=99∶1。常用。2.乙醇－乙醚液：95%乙醇49.5ml,乙醚49.5ml,冰醋酸1ml。較常用。3.甲醇：滴加在干燥涂片上，用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆薩染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色。4.丙酮：適用于酮類染色。5.Carnoy液：由無水乙醇、氯仿、冰醋酸按6:3:1比例混成，適用于顯示核酸、糖原、黏液染色。涂片在Carnoy液固定3～5min后，應(yīng)移入95%乙醇中繼續(xù)固定。6.對于液體標(biāo)本的離心沉淀物、試管拉網(wǎng)獲取的小塊組織或吸出物中的細(xì)小組織塊等，固定于4%中性甲醛液中1h，然后制作常規(guī)石蠟包埋切片。（三）固定方法1.浸入法：（1）將稍微干燥（不能完全干燥）的涂片直接浸泡于固定液內(nèi)至少15～30min.（2）因細(xì)胞容易脫落，宜以一個(gè)盛有固定液的容器只固定一例標(biāo)本的涂片；一個(gè)容器固定多例涂片時(shí)，有可能造成的腫瘤細(xì)胞交叉污染。（3）必要時(shí)可將標(biāo)本涂在硅化載玻片上，以防脫落。（4）固定液重復(fù)使用時(shí)，應(yīng)先用濾紙過濾。(5)95%乙醇固定液多次重復(fù)使用時(shí)，需測定其濃度比重，乙醇濃度低于90%時(shí)應(yīng)予棄用。2.滴加法：將固定液滴加于平放的干燥涂片上，應(yīng)避免因固定液揮發(fā)造成沉淀。（四）固定后未染色涂片的保存或郵寄：涂片固定15min后取出，立即滴加數(shù)滴甘油于涂膜上。對該涂片進(jìn)行染色前，應(yīng)先將其置于95%乙醇中溶去甘油。五、涂片的染色最常用于細(xì)胞病理學(xué)涂片檢查的是蘇木素-伊紅（HE）染色和巴氏染色。一些特殊染色、組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色也用于細(xì)胞病理學(xué)的涂片檢查（參見第4章第一、二節(jié)）。（一）蘇木素-伊紅（HE）染色（參見本章第一節(jié)的“六”項(xiàng)）。（二）巴氏（Papanicolaou）染色巴氏染色時(shí)，細(xì)胞透明度好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，色彩豐富而鮮艷，主要用于婦科細(xì)胞學(xué)涂片、痰涂片和富含鱗狀上皮細(xì)胞的涂片檢查。1.試劑配制(1)Harri蘇木素液（參見本章第一節(jié)的“六”項(xiàng)）（2）鹽酸-乙醇液濃鹽酸1ml70%乙醇99ml（3）橙黃G6液橙黃G60.5g蒸餾水5ml無水乙醇95ml磷鎢酸0.015g先將橙黃G溶于蒸餾水中，再加入無水乙醇，然后加入磷鎢酸。(4)EA36染液①EA36儲備液A液：亮綠0.5g，溶于5ml蒸餾水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。B液：伊紅0.5g，溶于5ml蒸餾水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。C液：俾斯麥棕0.5g，溶于5ml蒸餾水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。②EA36工作液EA36儲備液的A液45mlEA36儲備液的B液45mlEA36儲備液的C液10ml磷鎢酸0.2g碳酸鋰飽和水溶液1滴2.染色程序（1）將已經(jīng)固定的涂片置于80%乙醇中2min。（2）蒸餾水洗2min。（3）蘇木素液染核10～12min，自來水洗。（4）鹽酸-乙醇液分解約20～30s，至涂片呈淡橙紅色。（5）流水沖洗10～15min，蒸餾水洗。（6）依次用80%、95%乙醇脫水，各2min。（7）橙黃G6液染色3～5min。(8)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。(9)EA36工作液染色3～5min。(10)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。（11）無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：細(xì)胞核呈深藍(lán)色，核仁呈紅色；不同分化類型的鱗狀上皮細(xì)胞，其胞漿顏色各異：角化細(xì)胞呈粉紅色，不全角化細(xì)胞呈橙黃色，角化前細(xì)胞呈淡藍(lán)或淡綠色；紅細(xì)胞呈橙紅或鮮紅色，白細(xì)胞的胞漿呈淡藍(lán)綠色；黏液呈淡藍(lán)或粉紅色。（三）瑞氏（Wright）染色瑞氏染色一般用于血液涂片，也可用于檢查腫瘤細(xì)胞。1.試劑配制（1）瑞氏染液瑞氏染料1g甲醇600ml將瑞氏染料放入研缽內(nèi)，加入適量甲醇與之混合研磨，使染料逐漸溶解。將溶解的染液傾入另一玻璃瓶內(nèi)，然后再加入適量甲醇繼續(xù)研磨；未溶解的染料如此反復(fù)多次，直至染料完全溶解、甲醇用完為止。染液避光保存?zhèn)溆谩＃?）磷酸鹽緩沖液無水磷酸氫二鈉6.5g磷酸二氫鈉4g蒸餾水1000mlpH:6.5~7.02.染色程序(1)涂片自然干燥。（2）滴加瑞氏液染色1min。(2)滴加等量的磷酸緩沖液，輕輕搖蕩玻片或用洗耳膠球在玻片上輕輕吹氣，使兩液體混合均勻，持續(xù)10～15min。（4）流水洗去染液。（5）涂片風(fēng)干后，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：胞核呈紫紅色，胞漿呈紫藍(lán)色，黏液呈粉紅色或淡藍(lán)色。（四）May-Grünwald-姬姆薩（Giemsa）染色May-Grünwald-吉姆薩染色適用于造血系統(tǒng)的細(xì)胞涂片和鑒別惡性淋巴瘤的類型。May-Grünwald原液和姬姆薩原液配制煩瑣，可直接購買。1.試劑配制(1)May-Grünwald工作液May-Grünwald原液1份蒸餾水6～10份使用前配制。（2）姬姆薩工作液姬姆薩原液1份蒸餾水6～10份使用前配制。2.染色程序（1）涂片自然干燥，蒸餾水洗1～2min。(2)May-Grünwald工作液染15～30min。（3）自來水沖洗，洗去載玻片上的染液，蒸餾水清洗。（4）姬姆薩工作液染15～30min。（5）自來水沖洗，洗去載玻片上的染液。（6）涂片風(fēng)干后，二甲苯透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：胞核呈紫紅色，胞漿和核仁呈藍(lán)紫色。（五）Rakoff染色Rakoff染色用于陰道細(xì)胞學(xué)涂片快速測定雌激素水平。1.試劑配制(1)5%淡綠水溶液83ml(2)1%伊紅水溶液17ml將兩液混合后使用。2.染色程序（1）用細(xì)胞刷沿陰道側(cè)壁刷取黏膜鱗狀上皮細(xì)胞，放入裝有1～2ml生理鹽水的試管內(nèi)。（2）在試管內(nèi)滴入3滴Rakoff染液，用細(xì)胞刷在染液中輕搖混合。（3）將1~2滴混合液滴于載玻片上，制成涂片。（4）待涂片干燥后，用中性樹膠封片。染色結(jié)果：鱗狀上皮細(xì)胞的嗜酸性和嗜堿性胞漿區(qū)分明顯。角化前細(xì)胞的核呈網(wǎng)狀，角化細(xì)胞的固縮核呈基本不著色的空泡狀。（六）猩紅-固綠染色猩紅-固綠染色用于顯示性染色體。1.試劑配制(1)猩紅染液水溶性比布里西猩紅1.0g磷鎢酸0.3g冰醋酸5.0ml50%酒精100ml（2）固綠染液：固綠0.5g磷鉬酸0.3g磷鎢酸0.3g冰醋酸5.0ml50%乙醇100ml2.染色步驟（1）涂片經(jīng)95%乙醇固定后，置于70%乙醇中2min。（2）猩紅染液中5min。(3)50%乙醇中漂清多余染液。（4）固綠染液中分解2～5h。每小時(shí)在顯微鏡下觀察胞漿和網(wǎng)狀核膜是否呈現(xiàn)綠色；如果綠色滿意，立即取出涂片（一般約需4h）。固鎖核呈鮮紅色。(5)50%乙醇中5min。（6）依次置于70%、95%和無水乙醇中各2min。（7）置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明，各2min。（8）中性樹膠封片。染色結(jié)果：胞核呈淡綠色；性染色質(zhì)呈粉紅色、V字形或貼著于細(xì)胞膜呈三角形。在性染色質(zhì)周圍可見空泡。（七）Fouchet染色Fouchet染色用于顯示膽色素。1.染液配制Fouchet染液A液：25%三氯醋酸水溶液B液：10%三氯化鐵水溶液A.B液皆小量新鮮配制為宜。使用時(shí)，取A、B液各30ml混勻（當(dāng)天使用）。2.染色步驟（1）涂片經(jīng)95%酒精固定后，置于蒸餾水中漂洗。(2)Fouchet液中染5min。（3）蒸餾水Ⅰ、Ⅱ中各1min。（4）苦味品紅溶液中染5min。(5)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中漂洗。（6）無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脫水。（7）二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，中性橡膠封片。3.染色結(jié)果：膽色素呈橄欖綠色，膠原纖維呈紅色，涂片背景呈黃色。（八）硫酸亞鐵染色硫酸亞鐵染色用于顯示黑色素。1.試劑配制(1)2.5%硫酸亞鐵水溶液（2）鐵氰化鉀醋酸液鐵氰化鉀1g蒸餾水99ml冰醋酸1ml(3)1%冰醋酸水溶液（4）核固紅液[參見第4章第一節(jié)的八（三）項(xiàng)（愛先藍(lán)法）]2.染色程序（1）涂片經(jīng)95%酒精固定后，置于蒸餾水中漂洗1～2min。(2)2.5%硫酸亞鐵溶液中1h。（3）蒸餾水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中漂洗，各1min。（4）鐵氰化鉀醋酸液中30min。(5)1%冰醋酸液中1min。（6）蒸餾水漂洗。（7）核固紅液中染1～2min。（8）蒸餾水