上海市食品藥品檢驗所2021年5月27徐偉東二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設四微生物污染監管方式的思考五背景介紹一一、背景介紹在1993-1998年間，美國FDA報告的由微生物污染引起的召回案件到達1370件，占所有產品召回案件的36%我國藥品微生物污染的調查數據較少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龍江完達山刺五加注射液受微生物污染的問題，已經造成了十分嚴重后果和無法挽回的損失。藥品平安管理仍存在監管漏洞，造成定性難、溯源難、應變慢等問題，以及新的致病微生物或變異體的出現，導致藥品受到微生物污染我國各大城市不斷承辦國際大型體育賽事和國際會議尤其是2021年在我國召開的上海世界博覽會，也進一步增強了對藥品的監督管理水平的要求。對微生物分類水平較低，只能鑒定到“屬〞，鑒定微生物種類有限傳統微生物鑒定方法的局限分子方法傳統方法人類的土壤微生物已到達10萬種現在常用的微生物鑒定用生化反響只有20多種，實際經過研究形成一致標準的、有意義的生化鑒定結果僅2000多種。微生物生化鑒定金標準的API鑒定系統——僅能鑒定550種細菌通過碳源利用進行微生物鑒定的Biolog系統也僅能鑒定2000種微生物微生物變異能力強，生化反響準確度不高，錯檢漏檢現象普遍傳統微生物鑒定方法的局限生化反響鑒定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系統，根據微生物利用分解底物的種類和營養來源進行分類鑒定。在大多數情況下，同“屬〞微生物的酶系統根本相同，可以到達鑒定的目的微生物DNA突變能力強，如果這些突變點涉及到微生物酶系統的表達，就會造成酶活性降低甚至酶缺陷，導致鑒定失敗在現行國家標準中，只有血漿凝固酶陽性反響才會被確證為金黃色葡萄球菌陽性，陰性反響的微生物那么被作為無害菌處理。然而，近幾年引起高度關注的血漿凝固酶陰性金黃色葡萄球菌的流行使得金黃色葡萄球菌被漏檢，血漿凝固酶陰性金黃色葡萄球菌往往含有腸毒素和其他毒素，是引起醫院感染、社區食物中毒的重要污染源。不能對微生物污染進行準確溯源分析傳統微生物鑒定方法的局限在進化過程中生物DNA分子會形成大量DNA多態性區域和非編碼DNA序列。不會造成生物種屬歸類爭議也不會造成任何形態上或酶系統表達的改變通過生化鑒定方法無法對這類變化進行有效的分析DNA位點變化卻包含大量重要的微生物所獨有的進化信息，可以與其他來源的同種微生物相區別，也是微生物種內差異的來源如常用于真菌種類鑒定的ITS基因ITS片段能保持相對穩定的變異頻率親緣關系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現出差異，顯示最近的進化特征二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設四微生物污染監管方式的思考五背景介紹一2.2方法比較2.2方法比較革蘭氏染色鏡鑒按照標準進行傳統的生化反響鑒定API試劑條菌鑒定國際金標準半自動細菌鑒定儀〔ATBExpression〕

全自動細菌鑒定儀（VITEK2）微生物鑒定手段MiniVIDAS篩選系統免疫凝集/免疫沉淀實驗微生物檢測手段熒光定量PCR(BAX)傳統篩選方法GenBankPCR基因分型分子雜交陽性菌分子水平上的鑒定12341.形態學鑒定3.核糖體水平上的鑒定APIVITEK16SrDNA序列分析分子雜交〔DupontRiboPrinter〕2.生化鑒定傅里葉紅外光譜Rep-PCR(DiversiLab)4.全基因組水平上的鑒定API試劑條——菌鑒定國際金標準無需專用儀器，標準化手工方法完成細菌的生化鑒定，為低本錢替代傳統手工細菌生化鑒定的最正確產品。特點：完整的鑒定譜：15種試條，可鑒定的細菌多于550種簡單方便：標準化方法，本錢低廉，判讀結果簡單快速結果：4-24小時。半自動細菌鑒定儀〔ATBExpression〕檢測工程：可鑒定由環境、原料及制成品別離出的菌種和藥敏試驗〔包括：腸桿菌、非發酵G〔-〕桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌、厭氧菌〕。可鑒定770種細菌和分析近80種抗生素藥敏實驗。原理：鑒定試條包含風干底物的反響孔，經標準濁度的菌液活化，于指定溫度培養4小時/24小時后即可。計算機根據閱讀器檢測到的結果自動調用相應試劑條數據庫，得出生化/同化結果和藥敏試驗結果。系統將所得編碼跟數據庫的典型菌株生化譜比較，以客觀的2個參數〔鑒定百分率及T-值〕計算鑒定結果特點：速度快捷ATBExpression提供自動化接種，閱讀及分析試條結果。準確可靠的結果ID32及快速ID32試條由金牌標準API試條改進而成，配合自動化概念，結合成完整的細菌鑒定系統全自動細菌鑒定儀〔VITEK2〕檢測工程：根據需要鑒定的微生物的種類的不同，設計了不同的鑒定卡片，比方革蘭氏陰性菌卡，革蘭氏陽性菌卡，酵母菌卡等。可鑒定405種細菌，70多種藥物約50多種藥物組合的藥敏卡。原理：儀器的原理其實就是我們進行細菌鑒定中使用的生化反響。儀器把30個對細菌鑒定必需的生化反響培養基固定到卡片上，然后通過培養后儀器對顯色反響進行判斷，利用數值法進行判定。特點：快速：鑒定結果平均只需4-6小時。對與快速生長細菌(大腸埃希氏、糞腸球菌、變形桿菌、克雷伯氏菌等)鑒定可提前到2小時。操作簡便：全部操作自動化，簡單而方便資料處理：bioLIAISON軟件集中管理實驗室資料獲得AOAC國際認證：保證提供的微生物鑒定結果是公認的全自動熒光免疫分析儀(mini-VIDAS)

檢測工程：食品及環境中最常見致病性細菌〔李斯特菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸桿菌O157、沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測〕的快速篩檢。熒光定量PCR微生物檢測限可能到達1CFU/mL以下，而且抗雜菌干擾能力強a)近紅外傅立葉光譜分析b)色譜分析物質成分分析紅外傅立葉光譜分析德國Bruker公司微生物FT-IR分析用戶手冊主要采用1200-900ｃｍ-1，3000-2800ｃｍ-1，1500-1400ｃｍ-1譜段組合進行微生物判別分析，這3個譜段分別主要代表了微生物細胞壁多聚糖、細胞膜脂肪酸以及細胞質膜蛋白質和類脂成分的信息。色譜分析微生物中含有的一些稱為生物標志物的化學物質，其含量或結構具有種屬特征或與其分類位置密切相關通過分析微生物的化學組成鑒定微生物，開辟了一個微生物檢測和鑒定的新途徑高效液相色譜(High-performanceliquidchromatography，HPLC)氣相色譜(Gaschromatography，GC)氣相色譜質譜聯用(Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)建立各種生物標志物在微生物中分布情況的數據庫及相應的標準分析程序，仍然是色譜分析微生物的主要方向2.2方法比較各種鑒定方法的比較我所抗生素室通過比較分析近百種微生物的生化鑒定方法〔API和VITEK2鑒定〕和分子生物學方法鑒定方法，客觀準確的多方面評價各種方法的優劣二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設四微生物污染監管方式的思考五背景介紹一3.1細菌鑒定3.2溯源分析3.1細菌鑒定3.2溯源分析3.1細菌鑒定3.2溯源分析二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設四微生物污染監管方式的思考五背景介紹一

增強藥品中微生物檢驗能力，做到數據可信，國際認可，為執法、仲裁提供依據政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環境監控，構建環境微生物分布圖，提高檢測結果公信力與國際標準接軌，監控藥品生產環境，構建藥品生產微生物風險評估體系應用范圍廣，擴展能力強，醫療器械、食品、醫院等領域廣泛運用4.14.24.34.4

增強藥品中微生物檢驗能力，做到數據可信，國際認可，為執法、仲裁提供依據政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環境監控，構建環境微生物分布圖，提高檢測結果公信力與國際標準接軌，監控藥品生產環境，構建藥品生產微生物風險評估體系應用范圍廣，擴展能力強，醫療器械、食品、醫院等領域廣泛運用4.14.24.34.4微生物檢測實驗室應首先確保實驗室的設施和環境不會對檢驗過程帶來微生物污染只有排除檢測過程中的微生物污染，才能保證檢驗結果的準確性，才能有足夠的理由相信，樣品污染來自藥品本身，而不在檢驗過程中被污染的對檢測機構而言，自身檢測環境的控制要比樣品檢測更加重要公正準確科學高效加強檢測的“過程控制〞建立實驗室環境微生物信息庫、動態監控環境微生物的變化、建立環境微生物污染趨勢分析圖，預測微生物污染方向，從被動的排查污染措施上升到主動的預防、預警。如果樣品檢驗過程中不合格，別離鑒定樣品中的微生物，與環境微生物數據庫比較、分析微生物污染來源，出具客觀的檢測報告，杜絕實驗結果假陽性和假陰性的發生樣品接收樣品擺放樣品分發環境設施儀器實驗過程結果報告①登記樣品名稱，檢查是否具有唯一性標識，并檢查是否與運轉表內容一致②看樣品外包裝是否完整、密封,是否能保持無菌狀態符合檢驗要求③樣品數量是否符合檢驗要求樣品接收原始記錄原始記錄審核檢測過程控制樣品分發環境設施儀器實驗過程結果報告①根據樣品的貯存條件進行冷藏、冷凍或常溫放置②將樣品分區域〔在檢、待檢、檢畢〕擺置③冰箱和冰柜的溫度記錄樣品擺放樣品擺放樣品接收原始記錄原始記錄審核檢測過程控制環境設施儀器實驗過程結果報告①環境和設施等的質量管理②儀器狀態是否正常〔是否在計量標志的有效期內〕③做好儀器使用記錄儀器設施環境樣品接收樣品擺放樣品分發原始記錄原始記錄審核檢測過程控制樣品分發環境設施儀器實驗過程結果報告實驗過程樣品接收樣品擺放原始記錄原始記錄審核檢測過程控制樣品分發環境設施儀器實驗過程結果報告①完全按SOP書寫，所寫即所做的內容②統一原始記錄的格式和內容③按既定期限完成原始記錄的書寫④按不同來源分別輸入結果原始記錄樣品接收樣品擺放原始記錄原始記錄審核檢測過程控制樣品分發環境設施儀器實驗過程結果報告①原始記錄的完整性②檢驗數據的正確性③結果判斷的合理性原始記錄審核樣品接收樣品擺放原始記錄審核原始記錄檢測過程控制樣品分發環境設施儀器實驗過程結果報告陰性結果直接報告陽性結果→鑒定結果報告樣品接收樣品擺放原始記錄原始記錄審核檢測過程控制建立環境微生物菌株信息庫實驗室潔凈環境微生物監控頭狀葡萄球菌〔Staphylococcus

capitis〕溶血葡萄球菌〔Staphylococcus

haemolyticus〕緩癥鏈球菌〔Streptococcus

mitis〕科氏葡萄球菌〔Staphylococcus

cohnii〕藤黃微球菌〔Micrococcus

luteus〕常見潔凈環境微生物污染

實驗室潔凈環境微生物監控建立實驗室潔凈區采樣方案?醫藥工業潔凈室〔區〕懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法?〔GB/T16292~16294—1996〕?藥品生產質量管理標準?〔1998〕以一個月為周期，連續監測實驗室環境不定期對無菌室潔凈環境進行抽樣調查，積累潔凈環境微生物種群和分布數據檢查內容包括沉降菌檢測、浮游菌檢測、表面微生物檢測和操作人員衛生檢測等在實驗環境中以葡萄球菌屬〔Staphylococcus〕別離數目最多為34%微球菌屬〔Micrococcus〕和芽孢桿菌屬〔Bacillus〕次之，分別為19.15%和17.04%假單胞菌屬〔Micrococcus〕、莫拉菌群〔Moraxella〕、短波單胞菌屬〔Brevundimonas〕占4.26%短桿菌屬〔Brevibacterium〕、不動桿菌屬〔Acinetobacter〕、鞘氨醇單胞菌屬〔Sphingomonas〕、泛菌屬〔Pantoea〕等所占比例歸于其他項中收集的環境微生物中酵母菌占8.51%，主要為近平滑假絲酵母〔Candidaparapsilosis〕和粘紅酵母〔Rhodotorulamucilaginosa〕霉菌等絲狀真菌占4.26%，主要為青霉菌屬

我所實驗室潔凈環境微生物監控

我所環境微生物菌株信息庫的建立我們連續三個月對實驗室潔凈環境中局部環境微生物進行追蹤，并進行同源性分析以葡萄球菌屬為例，本實驗室共收集到16株葡萄球球菌屬細菌。7、8月分別收集到的細菌239與250和232與246之間同源性較高，歸在一個子類中，屬于同源污染。說明7月和8月之間的消毒滅菌過程不徹底，存在消毒漏洞。經過消毒，在9月份監測過程中收集到的葡萄球菌中未發現有和前兩月同源的菌株，說明前期的污染已經消除，9月份收集到的局部葡萄球菌為新進入環境的微生物。同一株菌反復污染潔凈環境要引起檢驗人員高度重視僅靠潔凈室內部消毒措施很可能起不到排除污染的作用要對潔凈室送風系統和檢驗人員攜帶污染進行全面調查建立環境微生物污染趨勢分析圖，預測微生物污染方向，從被動的排查污染措施上升到主動的預防、預警。將污染信息并與歷史污染物比對，回憶調查，幫助質量體系的改進。微生物進行鑒定菌株來源共241株

增強藥品中微生物檢驗能力，做到數據可信，國際認可，為執法、仲裁提供依據政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環境監控，構建環境微生物分布圖，提高檢測結果公信力與國際標準接軌，監控藥品生產環境，構建藥品生產微生物風險評估體系應用范圍廣，擴展能力強，醫療器械、食品、醫院等領域廣泛運用4.14.24.34.4

在藥品微生物檢驗中的應用在細菌污染檢查中的應用分離純化得到單菌落菌落形態檢驗DNA提取構建系統發育樹分子生物學鑒定通用引物擴增細菌16SrDNA

序列16SrDNA序列分析鑒定結論樣品接收革蘭氏染色API鑒定形態鑒定生化鑒定VITEK鑒定細菌的鑒定流程圖

在真菌污染檢查中的應用

在真菌污染檢查中的應用現行國標僅能夠對曲霉屬，青霉屬，鐮刀菌屬等少數幾個種屬的霉菌進行鑒定。我國的食品衛生微生物學檢驗國家標準中，對于青霉菌的鑒定需要在別離純化后培養12-14天，再對其孢子及菌絲進行形態學觀察。真菌孢子易于在空氣中飄散，難以殺滅，對實驗室環境和檢驗人員平安具有潛在污染風險。分子生物學鑒定技術有效的解決了區分污染來源的問題。該方法不需要使用選擇性培養基，純化后即可進行菌種鑒定。對真菌的菌絲體和孢子均能夠進行DNA的提取，避免霉菌產生的大量孢子對實驗室工作環境帶來的潛在污染危害真菌的鑒定流程圖分離純化得到真菌樣品的單菌落真菌菌落形態觀察真菌DNA的提取構建系統發育樹分子生物學評價通用引物擴增真菌ITS序列ITS序列在GenBank中進行Blast分析鑒定結論

增強藥品中微生物檢驗能力，做到數據可信，國際認可，為執法、仲裁提供依據政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環境監控，構建環境微生物分布圖，提高檢測結果公信力與國際標準接軌，監控藥品生產環境，構建藥品生產微生物風險評估體系應用范圍廣，擴展能力強，醫療器械、食品、醫院等領域廣泛運用4.14.24.34.4對藥廠生產環境監管和風險評估上應用上海某藥業產品受微生物潛在污染風險上海某藥業無菌產品微生物污染溯源某醫療器材滅菌方法研究對藥廠生產環境監管和風險評估上應用某制藥廠沉降菌同源性分析檢測實驗室微生物信息庫制藥企業微生物信息庫同源性分析比對污染源是否鑒定

增強藥品中微生物檢驗能力，做到數據可信，國際認可，為執法、仲裁提供依據政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環境監控，構建環境微生物分布圖，提高檢測結果公信力與國際標準接軌，監控藥品生產環境，構建藥品生產微生物風險評估體系應用范圍廣，擴展能力強，醫療器械、食品、醫院等領域廣泛運用4.14.24.34.44.4應用范圍廣，擴展能力強，可進行產品真偽鑒別和致敏原檢測二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設四微生物污染監管方式的思考五背景介紹一企業自查政府監管微生物樣本的采集微生物菌株鑒定企業環境控制及污染溯源能力新型監管模式的建立構建微生物分布圖建立菌種信息庫

A類企業：分子水平B類企業：生化水平C類企業：境檢、API水平企業－－微生物鑒定到“屬〞藥檢所－－－鑒定到“種〞“菌珠〞五、上海醫藥企業微生物污染的監督、管理和風險評估新模式的建立－－－新的監管模式流程圖

新的監管模式流程圖食品藥品監督管理局科學規劃企業內部自查局各職能部門外部督察

上海醫藥企業微生物污染的信息庫監督、管理和風險評估完善對制藥企業的風險分級監管建立和健全日常監督檢查方法強化企業微生物風險管理意識建立藥品污染源通報、追蹤平臺，完善藥品召回機制5.15.25.35.4幫助企業改進產品質量，打造醫藥平安公共研發平臺5.5五、上海醫藥企業微生物污染的監督、管理和風險評估新模式的建立5.1完善對制藥企業的風險分級監管對制藥企業分級管理往往依據藥品的產量、使用頻次及以往的污染事件嚴重性，對生產工藝和生產環境缺乏有效的數據監測，容易忽略潛在的微生物污染危害要是對文件資料的審查和經驗性的對加工條件和過程的評判，缺乏對微生物污染進行監控和調查的手段，僅能對生產環境和終產品的細菌總數和控制菌進行檢查，缺乏量化的評價指標傳統監管方法新監管方法上海共有制藥企業約200家上海地區被列為重點監控對象的注射劑、生物制品和特殊藥品三類高風險品種的生產企業僅有58家將臨時性的整頓深化為常態性的管理，可以使監管部門快速應對微生物性污染突發事件，為有效評估污染源的危害和范圍提供詳盡的第一手分析資料這些品種涉及范圍廣、產品使用頻繁，且容易發生微生物性藥品污染事件。逐步提高上海地區