基因工程基因工程的基本操作程序【學習目標】1.簡述目的基因的篩選和獲取方法2.簡述PCR的原理、條件及過程【重難點】利用PCR獲取和擴增目的基因轉基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左）與非轉基因抗蟲棉（右）

1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？從社會中來目的基因的篩選與獲取蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲。科學家通過實驗，將該細菌的“殺蟲基因”轉到棉花里，讓棉花也能產生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。這個“殺蟲基因”就是培育轉基因抗蟲棉用到的目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因主要指編碼蛋白質的基因目的基因的種類：根據需求的不同，目的基因也不同，如生物抗逆性、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因那么，如何篩選與獲取目的基因呢？第一步：目的基因的篩選與獲取（篩選合適的目的基因）隨著測序技術的發展，以及序列數據庫（GenBanK）、序列比對工具（如BLAST）等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能從相關的已知結構和功能清晰地基因中進行篩選是較為有效的方法第一步：目的基因的篩選與獲取1.通過化學方法直接人工合成目的基因獲取目的基因的方法DNA合成儀要求：①基因比較小

②核苷酸序列已知的基因2.通過構建基因文庫獲取目的基因基因文庫種類：①基因組文庫（包含一種生物的所有基因）

②部分基因文庫（只包含一種生物的部分基因，如cDNA文庫）第一步：目的基因的篩選與獲取拓展：基因文庫的構建過程某生物體全部DNA許多DNA片段受體菌群體限制酶與載體連接、導入受體菌群體cDNA某生物體發育的某個時期的mRNA逆轉錄與載體連接、導入基因組文庫cDNA文庫第一步：目的基因的篩選與獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因（常用）蘇云金桿菌Bt基因？快速獲得大量Bt基因提取前提：已知目的基因或其上下游的核苷酸序列引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸（長度通常為20-30個核苷酸）⑴

全稱：聚合酶鏈式反應⑵

原理：DNA的半保留復制（在體外大量復制目的基因的核苷酸序列）⑶

原料：DNA模版、引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶第一步：目的基因的篩選與獲取復習回顧：DNA復制堿基互補配對原則（A與T、C與G配對保證復制的準確進行）(2)條件:4種游離的脫氧核苷酸DNA的兩條鏈DNA解旋酶、DNA聚合酶等ATP(3)復制原則:能量：模板：原料：酶：半保留復制、邊解旋邊復制(1)特點:合成子鏈解旋形成新DNA解旋酶DNA聚合酶第一步：目的基因的篩選與獲取第一步：目的基因的篩選與獲取

DNA復制和PCR反應的條件對比解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸（dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常為小的單鏈DNA至少需要2種引物）反應還需要其它條件，如控溫系統、緩沖液（一般添加Mg2+）---能夠調節pH，激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶第一步：目的基因的篩選與獲取（5）PCR擴增的過程5’3’3’5’3’5’5’3’

變性雙螺旋解開PCR儀①變性：當溫度超過90℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈第一步：目的基因的篩選與獲取②復性：溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合5’3’3’5’復性3’5’兩種引物3’5’注意：復性溫度過高會破壞引物與模板堿基互補配對

復性溫度過低，會造成引物與模板結合位點增加，導致非特異性產物增加第一步：目的基因的篩選與獲取③延伸：當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈5’3’3’5’延伸3’5’3’5’5’3’3’5’第一步：目的基因的篩選與獲取3’5’3’5’5’3’3’5’第一輪循環的產物作為第二輪反應模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環產物5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’第一步：目的基因的篩選與獲取5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’第二輪循環的產物作為第三輪反應模板，經過變性、復性和延伸三步產生第三輪循環產物5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’第一步：目的基因的篩選與獲取（6）

結果與鑒定①結果：重復循環多次，每一次循環后目的基因的量可以增加一倍，即成指數形式擴增（約為2n，其中n為擴增循環的次數水平電泳儀②鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物探究·實踐DNA片段的擴增及電泳鑒定DNA片段的擴增及電泳鑒定1.PCR在體外進行DNA片段的擴增原理PCR利用了DNA熱變性和DNA半保留復制的原理。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構像等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。DNA片段的擴增及電泳鑒定3.材料用具（1）試劑①4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。②電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。③PCR反應體系的配方(見教材)DNA片段的擴增及電泳鑒定（2）用具①PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）PCR儀微量離心管DNA片段的擴增及電泳鑒定DNA片段的擴增及電泳鑒定（1）移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。PCR反應體系的配方10倍濃縮的擴增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA

5-10ul總體積50ul（2）離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部。（3）擴增：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。4.方法步驟（PCR）DNA片段的擴增及電泳鑒定4.方法步驟（電泳鑒定）（1）配制瓊脂糖溶液：根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。（2）制備凝膠：將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。DNA片段的擴增及電泳鑒定（3）加樣：將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）。（4）電泳、觀察：接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。DNA片段的擴增及電泳鑒定注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。DNA片段的擴增及電泳鑒定5.結果分析與評價：（1）你是否成功擴增出

DNA

片段的斷依據是什么？在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度（條帶的分布代表擴增產物的類型；條帶的粗細代表擴增產物量的多少）。（2）通過電泳條帶能否確定擴增產物一定是所需的DNA片段？為什么？不能；因為電泳條帶僅能顯示擴增片段的大致長度，不能顯示精準的DNA堿基數量，也不能呈現堿基序列。課堂小結目的基因的獲取與篩選篩選合適的目的基因獲取目的基因測序技術、序列數據庫、序列對比工具利用化學方法人工合成目的基因通過構建基因文庫獲取目的基因利用PCR獲取和擴增目的基因隨堂練習1.下列不屬于獲取目的基因的方法的是(

)A.從基因組文庫中獲取目的基因B.利用PCR技術體外擴增目的基因C.利用逆轉錄法獲取目的基因D.利用DNA連接酶復制目的基因答案：D

解析：獲取目的基因的方法有：從基因組文庫中獲取目的基因、利用PCR技術體外擴增目的基因、利用逆轉錄法獲取目的基因等。DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，利用DNA連接酶不能復制目的基因，故選D。隨堂練習2.傳統的多重PCR（MPCR）是在普通PCR的基礎上，在同一個反應體系中加入不同的引物對，針對不同的模板或同一模板的不同區段進行特異性的擴增，從而得到多個目的片段的技術。隨著科學技術的發展，MPCR技術在擴增方面取得新的突破，不再局限于在同一反應管中進行擴增，而是將不同的引物對和模板分散于相應獨立的空間中進行擴增。下列相關敘述錯誤的是(

)A.對于同一DNA片段的不同區段進行擴增時，不同引物的堿基排列順序不能互補B.同一反應體系中擴增不同模板時需加入更多耐高溫的DNA聚合酶才能使擴增正常進行C.在目的DNA片段擴增時，若復性階段溫度控制過高，可能導致無產物D.PCR擴增DNA時打開雙螺旋的方式與細胞內不同，實質都是磷酸二酯鍵斷裂解析：A.對同一模板不同區段進行擴增時，不同引物的堿基排列順序不能互補，如果互補就會形成雙鏈，不能與模板鏈結合，不能完成擴增，A正確；B.在同一反應體系中擴增不同模板時需要加入更多耐高溫的DNA聚合酶才能使擴增正常進行，因為擴增不同片段需要結合的酶的數量較多，B正確；C.在目的片段擴增時，溫度的控制是實驗成敗的關鍵，若復性階段溫度控制過高，導致引物不能與模板鏈結合，可能導致無產物，C正確；D.PCR擴增DNA時通過高溫將雙螺旋打開，而細胞內進行DNA復制通過解旋酶將雙螺旋打開，二者斷裂的都是氫鍵，D錯誤。D隨堂練習3.反向PCR是一種通過已知序列設計引物對未知序列進行擴增的技術,其過程如圖所示。下列敘述正確的是(

)A.環化階段,可選E.coli

DNA連接酶而不能選T4DNA連接酶B.圖中環狀DNA進行PCR的過程中,沿左側引物延伸子鏈的方向是逆時針C.PCR產物是包含所有已知序列和未知序列的環狀DNA分子,其中含有EcoRI的酶切位點D.應選擇引物2和引物3進行PCR擴增答案：B

解析：圖示末端為黏性末端,所以環化階段,可選E.coli

DNA連接酶也能選T4DNA連接酶,A錯誤。據圖中未知序列的位置可知,圖中環狀DNA進行PCR的過程中,沿左側引物延伸子鏈的方向是逆時針,沿右側引物延伸子鏈的方向是順時針,B正確。根據題意和圖示可知,DNA分子被限制酶EcoRI切割后環化,再通過PCR擴增得到包含所有已知序列和未知序列的鏈狀DNA分子;未知序列含有EcoRI的切割位點,故PCR產物含有EcoRI的酶切位點,C錯誤。DNA子鏈合成的方向是5'→3',要通過已知序列設計引物,應選擇引物1和引物4進行PCR擴增,D錯誤。隨堂練習4.熒光定量PCR技術是在常規PCR的基礎上，加入與模板DNA某條