第2節(jié)

動物細胞工程——動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物賀老師第2章細胞工程中國古代的奇思妙想“（悟空）拔一把毫毛，丟在口中嚼碎，望空噴去，叫一聲‘變！’，即變作三二百個小猴，周圍攢簇（cù）。”這是《西游記》中的一段描述，展示了中華先賢的想象力。問題探討克隆猴：“中中”和“華華”2、毫毛來自體細胞，我們能用體細胞“變”出一群猴嗎？1、為什么以前我們覺得這是奇思妙想？動物通常如何繁殖？動物通常通過精卵結(jié)合形成受精卵發(fā)育成新個體（有性生殖）思考：1.克隆猴的過程中最大的困難是什么？最大的困難是如何才能激發(fā)動物細胞表達其全能性。2.植物細胞具有全能性，所以可以直接利用其體細胞培育出克隆植物。可以直接利用動物細胞培育出克隆動物嗎？不能。因為動物細胞的全能性受到限制，不能經(jīng)培養(yǎng)直接發(fā)育成完整個體，所以動物通過體細胞核移植技術(shù)得到克隆動物。問題探討體細胞1.概念：將動物一個細胞的細胞核，移入去核的卵母細胞中，使這個重新組合的細胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動物個體的技術(shù)。2.原理：動物細胞核的全能性3.生殖方式：無性生殖動物細胞核移植技術(shù)卵母細胞動物體細胞去核取核移入重組細胞新胚胎克隆動物發(fā)育發(fā)育用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物。體細胞或者胚胎細胞的細胞核→保持優(yōu)良性狀4.種類：胚胎細胞核移植：體細胞核移植：細胞分化程度低，表現(xiàn)全能性容易細胞分化程度高，表現(xiàn)全能性十分困難動物細胞核移植技術(shù)動物體細胞核移植的難度明顯高于胚胎細胞核移植在體細胞核移植中，非人靈長類動物體細胞核移植非常困難：①供體的細胞核在去核卵母細胞中不能完全恢復(fù)其分化前的功能狀態(tài)，這導(dǎo)致了胚胎發(fā)育率低。具有許多與人類相似的生物學(xué)特征的靈長類動物②對非人靈長類動物胚胎進行操作的技術(shù)尚不完善。我國科學(xué)家經(jīng)過多年努力，攻克了這些障礙，終于成功獲得了世界上首例體細胞克隆猴。動物細胞核移植技術(shù)[思考]為何不稱為“克隆技術(shù)”而是“核移植技術(shù)”？克隆技術(shù)：是一個很廣的概念，凡指新形成的事、物與親本一致的現(xiàn)象均可稱為“克隆”。在生物學(xué)上，克隆是無性繁殖，具體地說，是指一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產(chǎn)生出來的一群遺傳特性相同的分子、細胞或個體。一般指DNA分子擴增，還包括單克隆抗體技術(shù)。由一個細胞分裂所形成的細胞群體。指基因型完全相同的個體或群體。分子水平：細胞水平：個體水平：思考：下列克隆分別用什么技術(shù)？動物克隆——

動物細胞克隆——植物克隆——

DNA克隆——動物細胞培養(yǎng)技術(shù)動物體細胞核移植技術(shù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)PCR技術(shù)動物細胞核移植的過程1997年，美國的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。思考：能否依據(jù)“多莉羊”的培育過程，進行優(yōu)質(zhì)奶牛的快速繁育？無性生殖→保持優(yōu)良性狀動物細胞核移植的過程收集牛卵巢，采集卵母細胞(研究人員正在使用設(shè)備從牛的卵巢采集卵母細胞)，在體外培養(yǎng)到MⅡ期（減Ⅱ中期）(1)為什么選擇卵母細胞作為核移植受體細胞？①卵母細胞體積大，易操作②含有促使細胞核表達全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件【如促成熟因子（MPF）其水平高低可影響供體染色體的狀態(tài)和復(fù)制】③卵黃多，營養(yǎng)物質(zhì)豐富。(2)為何要培養(yǎng)到MⅡ期？正常排出的卵細胞即處于MⅡ期，此時卵母細胞已發(fā)育成熟，細胞質(zhì)中具有激活重構(gòu)胚以及早期胚胎發(fā)育的必需因子。1卵母細胞的選擇（此時的細胞核核膜核仁消失，為紡錘體-染色體復(fù)合物）MⅡ期的次級卵母細胞高產(chǎn)奶牛(供體)從供體高產(chǎn)奶牛身體的某一部位(如耳)上取體細胞，進行細胞培養(yǎng)供體：提供細胞核的個體；有重要利用價值的動物的體細胞。（3）培養(yǎng)過程中，一般選用傳代10代以內(nèi)的細胞，為什么？因為當(dāng)傳代至10-50代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，而10代以內(nèi)的細胞一般能保持正常的二倍體核型，保證了供體細胞正常的遺傳基礎(chǔ)。動物細胞核移植的過程2供體細胞的選擇和培養(yǎng)動物細胞核移植的過程3卵母細胞去核★方法：顯微操作去核法也有人采用梯度離心、紫外線短時間照射和化學(xué)物質(zhì)處理等方法。優(yōu)點：使DNA變性失活，達到去核的目的。沒有刺破透明帶或卵母細胞質(zhì)膜，對卵母細胞傷害小。（1）卵母細胞去核的原因是什么？保證克隆動物的遺傳物質(zhì)盡可能來自于有重要利用價值的動物。實際是去除紡錘體-染色體復(fù)合物（2）“核”的實質(zhì)是什么？MⅡ期的次級卵母細胞動物細胞核移植的過程4供體細胞核移植到去核卵母細胞（1）將整個供體細胞注入卵母細胞中有何優(yōu)點？優(yōu)點：①保證供體細胞的細胞核

不被破壞，操作方便。

②傳遞線粒體DNA：（2）如何使兩個細胞發(fā)生融合？通過電融合法使兩細胞融合，供體核進入卵母細胞，形成重構(gòu)胚。電融合法實質(zhì)是直接將供體細胞注入去核卵母細胞的透明帶內(nèi)將整個供體細胞注入卵母細胞動物細胞核移植的過程4重構(gòu)胚的激活（2）激活重構(gòu)胚目的是？目的：使其完成細胞分裂和發(fā)育過程。重構(gòu)胚：是指人工重新構(gòu)建的胚胎，具有發(fā)育成完成個體的能力。（1）如何激活重構(gòu)胚？用物理或化學(xué)方法(如電刺激、Ca2+載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等)激活重構(gòu)胚胎通過電融合法使兩細胞融合，供體核進入卵母細胞，形成重構(gòu)胚。早期胚胎如電刺激、Ca2+

載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等動物細胞核移植的過程(代孕)母牛體內(nèi)生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛克隆動物早期胚胎（1）動物體細胞核移植技術(shù)證明了？（原理）該技術(shù)證明了：已分化的動物體細胞的細胞核具有全能性。（2）從遺傳物質(zhì)的角度分析，克隆動物是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？②生物性狀還受環(huán)境因素的影響。①克隆動物遺傳物質(zhì)來源核遺傳物質(zhì):全部來自

。供體動物的細胞核質(zhì)遺傳物質(zhì):一部分來自

細胞，另一部分來自

。供體受體卵母細胞③克隆動物在個體發(fā)育過程中有可能發(fā)生基因突變、染色體變異等可遺傳變異。5胚胎移植無性生殖表現(xiàn)型=基因型+環(huán)境采集卵母細胞，在體外培養(yǎng)到MⅡ期從供體高產(chǎn)奶牛身上取體細胞顯微操作去核對體細胞進行培養(yǎng)去核的卵母細胞供體細胞電融合法將供體細胞注入去核的卵母細胞重構(gòu)胚

用物理或化學(xué)方法激活早期胚胎將胚胎移入受體（代孕）母牛體內(nèi)生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛早期胚胎培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)胚胎移植動物細胞融合動物細胞核移植技術(shù)動物細胞核移植的過程6.供體細胞注入卵母細胞的優(yōu)點__________________7.誘導(dǎo)融合的方法____________________8.融合的結(jié)果______________________________9.重構(gòu)胚概念_________________________________________動物細胞核移植的過程1.采集的卵母細胞應(yīng)培養(yǎng)至_____________________2.選擇MⅡ期卵母細胞的原因①____________________________________②_________________________③_________________________3.卵母細胞去核的方法_________________4.“去核”去的是什么？________________________5.去核的原因________________________________________________________MⅡ期（減數(shù)分裂Ⅱ中期）卵母細胞內(nèi)卵黃多，營養(yǎng)物質(zhì)豐富細胞體積大，易于操作顯微操作（去核）法紡錘體-染色體復(fù)合物含有促進細胞核表現(xiàn)全能性的物質(zhì)使核移植得到的胚胎或動物核內(nèi)遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物對供體細胞損傷較小電融合法供體核進入卵母細胞，形成重構(gòu)胚人工重新構(gòu)建的胚胎，具有發(fā)育成完整個體的能力體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景（1）在畜牧生產(chǎn)中：加速家畜遺傳改良進程、促進優(yōu)良畜群繁育2018年，中國西北農(nóng)林科技大學(xué)成功克隆荷斯坦奶牛“妞妞”，其核供體為年產(chǎn)奶量超10噸的精英母牛。后續(xù)批量克隆的奶牛群體乳蛋白含量提升12%，繁殖效率提高30%。轉(zhuǎn)基因體細胞體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景（2）在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域：①通過建立轉(zhuǎn)基因體細胞系，再利用體細胞核移植技術(shù)培育的轉(zhuǎn)基因克隆動物可以作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)許多珍貴的醫(yī)用蛋白；乳腺生物反應(yīng)器如果科學(xué)家獲得了一個藥用蛋白基因，如何生產(chǎn)大量藥用蛋白？體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景（2）在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域：②在治療人類疾病時，轉(zhuǎn)基因克隆動物的細胞、組織或器官可以用于異種移植。③以患者作為供體培育的人核移植胚胎干細胞，經(jīng)過誘導(dǎo)分化能形成相應(yīng)的細胞、組織或器官，將它們移植給患者時可以避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。(治療性克隆)病人取核去核卵母細胞重構(gòu)胚胎各種細胞組織或器官誘導(dǎo)取出體細胞核移植移植成纖維細胞取出轉(zhuǎn)入相關(guān)因子各種細胞組織或器官iPS細胞取出胚胎干細胞誘導(dǎo)移植治療性克隆iPS細胞治療細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化體細胞核移植技術(shù)與誘導(dǎo)iPS細胞相比，有什么相似或不同之處？請你預(yù)測它們應(yīng)用前景的差異。體細胞核移植技術(shù)與誘導(dǎo)iPS細胞相比，有什么相似或不同之處？請你預(yù)測它們應(yīng)用前景的差異。體細胞核移植技術(shù)誘導(dǎo)iPS細胞過程細胞的來源操作難度都能生成干細胞，但它們的過程是完全不同的對核供體細胞有較高要求，一般情況下體細胞的分化程度越高，它重編為干細胞的成功率就越低可誘導(dǎo)成為iPS細胞的細胞來源相對廣些，研究表明成纖維細胞、B淋巴細胞、脂肪干細胞等都可以誘導(dǎo)成為iPS細胞涉及采集卵母細胞、去核、融合等復(fù)雜的操作技術(shù)流程相對簡單，可能更適合用于生產(chǎn)實踐目前科學(xué)家還在研究由這兩種技術(shù)生成的干細胞在基因表達、DNA甲基化等方面的差異，這些研究成果也將直接影響它們今后的應(yīng)用。（1）過程：利用體細胞核移植技術(shù)和誘導(dǎo)iPS細胞都能生成干細胞，但它們的過程是完全不同的。（2）細胞的來源：體細胞核移植技術(shù)對核供體細胞有較高要求，一般情況下體細胞的分化程度越高，它重編為干細胞的成功率就越低；可誘導(dǎo)成為iPS細胞的細胞來源相對廣些，研究表明成纖維細胞、B淋巴細胞、脂肪干細胞等都可以誘導(dǎo)成為iPS細胞。目前科學(xué)家還在研究由這兩種技術(shù)生成的干細胞在基因表達、DNA甲基化等方面的差異，這些研究成果也將直接影響它們今后的應(yīng)用。體細胞核移植技術(shù)與誘導(dǎo)iPS細胞相比，有什么相似或不同之處？請你預(yù)測它們應(yīng)用前景的差異。（3）操作難度：體細胞核移植技術(shù)涉及采集卵母細胞、去核、融合等復(fù)雜的操作；誘導(dǎo)iPS細胞的技術(shù)流程相對簡單，可能更適合用于生產(chǎn)實踐。體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景

①研究克隆動物可以使人類更深入地了解胚胎發(fā)育及衰老過程；②克隆一批遺傳背景相同的動物，可以通過它們之間的對比來分析致病基因；③克隆特定疾病模型的動物，還能為研究該疾病的致病機制和開發(fā)相應(yīng)的藥物

提供幫助。（3）在科研領(lǐng)域：北方白犀牛是全球最瀕危的哺乳動物之一，截至2024年，僅剩兩只雌性個體（納金和法圖），且均為不孕老齡，物種已處于功能性滅絕邊緣。為挽救這一物種，科學(xué)家嘗試通過體細胞核移植技術(shù)（克隆）結(jié)合基因編輯進行干預(yù)。該技術(shù)有望增加瀕危物種的存活數(shù)量。白鰭豚金絲猴體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景（4）在保護瀕危物種方面北方白犀牛相關(guān)資料：培育克隆羊多莉時，共獲得了277個融合的細胞，早期發(fā)育成功的胚胎卻只有29個，移植后成功懷孕的母羊僅有1只，成功率只有0.36%。培育體細胞克隆猴時，用了127個卵母細胞，獲得109個核移植胚胎，移植給21只代孕母猴，只有6只成功懷孕，最后只誕生了2只健康的小猴，成功率為1.57%。多莉在2003年2月15日，因肺部感染而死亡，壽命只有7歲，而普通羊的平