關于高效液相色譜-串聯質譜法測定牛肉中β-激動劑類藥物殘留的研究1.1實驗材料與設備牛肉：經檢驗β-受體激動劑呈現陰性的牛肉，絞碎均質。1.1.2主要試劑甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、高氯酸、氨水、氫氧化鈉溶液、乙酸銨緩沖液、甲酸水溶液-甲醇溶液(體積比=90:10)、β-葡萄糖醛酸酶(30U·mL-1)。對照品：萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇(含量均≥98%)。同位素內標：萊克多巴胺-d3、克倫特羅-d9、沙丁TSQQuantis型號高效液相色譜-串聯質譜儀：配電噴霧離子源(ESI);分析天平；氮吹儀；水平振蕩器；固相1.2混合對照品溶液及內標液的制備準確稱取萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇各10mg,放置于100mL的棕色量瓶內，用甲醇定容，將其制備為0.1mg·mL-1的混合對照品溶液，4℃避光保存?zhèn)溆茫R用時可用甲醇稀釋為所需濃度混合液。稱取3種同位素內標10mg,同樣的方法配置為100μg·mL-1的儲備液保存，用時可1.3樣品前處理稱取新鮮或者冷藏解凍的試料2g置于50mL離心管內，加入0.2mol-L-1的乙酸銨緩沖液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μl,渦旋均勻，于避光條件下37℃水浴振蕩16h,放至室溫備用。1.3.2萃取、凈化、濃縮取上步驟獲得備用液，加入100ng·mL-1的內標液100μL,渦旋均勻并在8000r·min-1的條件下離心8min,取上清液，加入5mL高氯酸溶液(0.1mol-L-1),渦旋均勻，用高氯酸調節(jié)pH至1,在8000r-min-1的條件下離心8min,在獲得的上清液中加入NaOH溶液(10mol-L-1),調節(jié)pH至10。加入乙酸乙酯15mL,中速振蕩5min,在5000r·min-1的條件下離心5min,獲取上層有機相。對于上層水相，可加入叔丁基甲醚10mL進行提取，將前后2次提取的有機相進行合并，50℃氮吹，并用甲酸溶液(2%)溶解備用[3]。應用混合型陽離子交換固相萃取柱進行凈化，分別用3mL甲醇及3%甲酸活化萃取柱后，備用液過柱后用2%甲酸與甲醇各3mL淋洗、抽干，用5%的氨化甲醇溶液3mL洗脫后50℃氮吹。用0.5mL甲醇-1%甲酸溶液溶解殘余物后過濾膜(0.22μm孔徑),獲得供試品溶液。1.4儀器條件色譜柱：WatersC18(XbridgeBEH2.5μm);柱溫：40℃;進樣量：20μL;流速：0.2mL·min-1;流動相：溶劑A+溶劑B。梯度洗脫程序見表1。表1流動相及梯度洗脫程序表離子源：電噴霧(ESI+);掃描方式：選擇反應檢測掃描(SRM);離子噴霧電壓：3500V;離子傳輸管溫度：320℃;蒸汽溫度：350℃;鞘氣流速：40Arb;輔助氣流速：5Arb。2.1酶解溫度的優(yōu)化通過查閱相關文獻得知，β-葡萄糖醛酸酶適用的溫度處于40~110℃,于試料牛肉離心管內，加入0.2mol·L-1的乙酸銨緩沖液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μL,渦旋均勻后分別于避光條件下37、45、53、61、69℃水浴振蕩16h,再經萃取、凈化、濃縮后對3種β-受體激動劑含量進行檢測，結果見表2。表2不同酶解溫度對β-受體激動劑測定結果的影響表表2顯示，當酶解溫度在37~45℃范圍內時，3種β-受體激動劑的測定結果差距不明顯，均與推薦值最接近，隨著溫度的繼續(xù)升高，在達到53℃后，測定值會有所降低，這可能因為溫度過高會導致物質揮發(fā)丟失。所以，最合適的酶解溫度為37℃[4-5]。設置樣品酶解與提取前處理的酶解時間為37℃下水浴振蕩8、12、16、20、24h,再經萃取、凈化、濃縮后對3表3不同酶解時間對β-受體激動劑測定結果的影響表表3顯示，酶解時間為8、12、16h時，β-受體激動劑含量測定值差距相對較小，均接近推薦值5μg-kg-1,適合酶解時間為8h。2.3凈化條件的優(yōu)化應用SPE技術凈化，分別創(chuàng)建4種淋洗液與洗脫程序，研究加標回收率，選擇最佳凈化條件，具體見表4。表4不同凈化條件的β-激動劑回收率表表4顯示，方法1與方法2下3種β-激動劑的平均回收率差異性不大，分別為98.5%、98.4%。因此，該實驗凈化條件可以選擇方法1或者方法2。2.4方法回收率分析各稱取牛肉樣品2g,按照上述最佳前處理條件，分別添加不同并定容至1mL,計算其分析結果及回收率見表5。表53種β-受體激動劑加標回收實驗結果表由表5可知，β-受體激動劑化合物的加標回收率處于84.6%～97.2%,代表該檢測方法具備較高的準確度，可以本實驗采用酶解與固相萃取的前處理技術和液質聯用對牛肉中的3種β-受體激動劑進行檢測，發(fā)現最佳的酶解溫度為37℃,酶解時間為8h,凈化條件