題型05生物技術與功能類模板01利用PCR技術獲取目的基因模板02利用PCR技術鑒定目的基因的連接方式模板01利用PCR技術獲取目的基因模板02利用PCR技術鑒定目的基因的連接方式模板03利用PCR技術引導基因定點突變識·命題特點明命題特點、窺命題預測明·答題模板答題要點+答題技巧+模板運用練·高分突破模板綜合演練，快速技巧突破本節導航命題點真題在線常見設問/關鍵詞微生物的基本培養技術2023·全國乙·T372022·天津·T32021·天津·T1設問關鍵詞：常規PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR發酵工程的原理及應用2023·山東·T202022·湖北·T132022·山東·T20基因工程的基本工具2023·新課標·T62021·全國乙·T382021·湖北·T7基因工程的應用2022·河北·T242022·廣東·T222022·全國乙·T382021·河北·T24動物細胞融合和單克隆抗體的制備2023·北京·T12023·湖北·T222022·山東·T152022·福建·T132021·山東·T152021·江蘇·T112020·全國Ⅰ·T38植物細胞工程的應用2023·山東·T14幾種不同PCR的應用2023·江蘇·T222023·山東·T252022·江蘇·T242022·山東·T252021·全國甲·T382021·山東·T252020·北京·T122020·江蘇·T33命題預測PCR技術是近年高考熱點，常涉及對PCR基本過程、引物的選擇、多種PCR的應用關鍵技巧掌握PCR過程的基本原理模板01利用PCR技術獲取目的基因獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現在常用PCR特異性地快速擴增目的基因。PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。該技術由穆里斯等人于1985年發明，為此，穆里斯于1993年獲得了諾貝爾化學獎。技巧01利用PCR技術獲取目的基因1．（2024·河南·模擬預測）數字PCR技術被稱為第三代PCR,在核酸定量檢測中具有突出優勢。該技術通過將一個樣本稀釋分成幾十至幾萬份，并分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析，計算初始樣品中靶標分子的拷貝數。據此分析，下列說法正確的是（）A．數字PCR技術僅適用于樣本中目標分子含量較高的材料B．數字PCR技術遵循的基本原理是DNA的邊解旋邊復制C．每個單元中加入等量的4種核糖核苷酸溶液作為擴增原料D．每個單元中目標分子的兩條子鏈合成都是從5'端向3'端延伸【答案】D【思路詳解】A、數字PCR技術把檢測樣本稀釋后分配到不同的反應單元，在每個單元進行一個或多個目標分子擴增，再對每個單元的擴增結果綜合分析，計算初始樣品中靶標分子的拷貝數。該技術對高、中、低水平的目標分子含量的材料均可實現正確、精密的測定，A錯誤；B、數字PCR技術遵循的基本原理是DNA半保留復制，B錯誤；CD、每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，需要加入4種脫氧核苷酸的等量混合液、與目標分子特異性結合的兩種引物和TaqDNA聚合酶等，兩條子鏈合成是從兩種引物的3'端開始連接脫氧核苷酸，C錯誤、D正確。（2024·安徽蕪湖·二模）不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產生大量單鏈DNA（ssDNA）的方法。加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物。PCR反應最初的若干次循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當限制性引物消耗完后，就會產生大量的ssDNA。不對稱PCR的簡單過程如圖所示。假設模板DNA分子初始數量為a個，6次循環后開始擴增產生ssDNA。下列有關敘述錯誤的是（

）A．限制性引物和非限制性引物均可與模板DNA單鏈結合B．不對稱PCR循環6次需要消耗（26-1）a個限制性引物C．最后獲得的ssDNA中不含非限制性引物D．子鏈的延伸都是從兩種引物的3'端開始的模板02利用PCR技術鑒定目的基因的連接方式檢測目的基因在受體細胞內是否穩定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標記基因、PCR技術和核酸分子雜交技術等方法鑒定受體細胞中是否轉入了目的基因。在實際操作中，PCR技術不僅可以精準地鑒定受體細胞是否轉入目的基因，還可以通過引物的巧妙設計鑒定目的基因的連接方式。【補充】利用PCR技術快速檢測病原體病原體檢測是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準確地確定病原體的存在和種類，發展了許多快速檢測方法。PCR技術是一種基于DNA擴增原理的快速病原體檢測方法，它能夠在幾小時內擴增和檢測極小量的病原體DNA，并且具備高度的特異性和敏感性。技巧02利用PCR技術鑒定目的基因的連接方式（2024·廣西·模擬預測）現將XplA和XplB兩種能降解彈藥使用后殘留的危險污染物的基因轉入實彈射擊場的柳枝稷草中。若要通過PCR檢測所獲轉基因柳枝稷草中是否含有正確插入的XplA和XplB基因，應選擇的引物組合是（

）A．引物1+引物3 B．引物1+引物2C．引物2+引物3 D．引物3+引物4【答案】A【思路詳解】根據啟動子的位置，若正確插入，模板鏈應為題甲圖中下鏈，則引物1應與下鏈的3'端結合，引物3可以結合題甲圖上鏈的3'端，若XplA和XplB基因正確插入，則使用引物1+引物3可通過PCR擴增出XplA和XplB基因融合片段，若Xp1A和XplB基因其中一個基因反接或者兩個都基因反接，通過PCR均無法擴增出Xp1A和XplB基因融合片段，因此，使用引物1+引物3通過PCR可檢測所獲轉基因柳枝稷草中是否含有正確插入的Xp1A和XplB基因，A正確；BCD錯誤。（2024·浙江紹興·一模）免疫PCR是對微量抗原的一種檢測方法。下圖是利用該技術檢測牛乳中微量抗生素的流程圖：首先將抗體1固定在微板上，沖洗后加入待檢的牛乳，再加入DNA標記的抗體2，進行PCR擴增，最后進行電泳檢測。下列相關敘述錯誤的是（）A．PCR擴增中延伸時間取決于引物的長度B．引物濃度大小會影響PCR擴增獲得產物的數量C．圖示過程中三次沖洗的目的均不同D．圖示抗原檢測過程發生兩次抗原與抗體的結合模板03利用PCR技術引導基因定點突變重疊延伸PCR技術是指在PCR技術的基礎上，采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項新技術。該技術在基因的定點突變、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有著獨特的應用。【補充】利用PCR技術擴增未知基因序列利用PCR技術進行基因擴增時，為了便于設計引物，要求目的基因兩側的序列是已知的。當DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術。技巧03利用PCR技術引導基因定點突變反向PCR是一種通過已知序列設計引物對未知序列進行擴增的技術，其過程如下圖所示。下列敘述正確的有（

）

A．應選擇引物1和引物4進行PCR擴增B．設計的引物中GC堿基含量越高，退火溫度越低C．PCR產物是包含所有已知序列和未知序列的環狀DNA分子D．在環化階段，可選E.coliDNA連接酶而不能選T4DNA連接酶【答案】A【思路詳解】A、DNA子鏈合成的方向為5'端到3'端，因此要通過已知序列設計引物對未知序列進行擴增應選擇引物1和引物4進行PCR擴增，A正確；B、GC堿基含量越高，堿基對間氫鍵的含量越多，退火的溫度越高，B錯誤；C、PCR產物是包含所有已知序列和未知序列的鏈狀DNA分子，C錯誤；D、在環化階段，因為圖示的末端為黏性末端，因此，既可選E.coliDNA連接酶也可選T4DNA連接酶，D錯。（2024·廣西·模擬預測）基因定點突變的目的是通過定向地改變基因內一個或少數幾個堿基來改變多肽鏈上一個或幾個氨基酸。該技術是蛋白質工程的重要技術，圖示為利用PCR技術進行定點突變的流程，相關敘述錯誤的是（

）

注：引物1和引物3的突起處代表與模板不能互補的突變位點，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補的。A．酶①應為耐高溫DNA聚合酶，引物X和Y為引物2和4B．將四種引物置于同一個反應系統中同時進行第一個階段的反應C．第一階段PCR過程中需要進行兩次循環才能得到兩種所需的DNA片段D．通過該技術獲得的突變基因可以表達出原來自然界不存在的蛋白質1．發酵工程在食品、醫藥、農牧業等方面有著廣泛地應用，下列有關說法正確的是（

）A．發酵工程的中心環節是滅菌，防止雜菌污染B．pH能影響發酵產物，谷氨酸的發酵生產過程中，堿性條件下易產生谷氨酰胺C．啤酒生產中的焙烤、蒸煮環節既可以殺菌，又可以使所有酶失活D．微生物飼料中的單細胞蛋白除蛋白質外還含有糖類、脂質、維生素等2．“細菌喜葷，霉菌喜素”，一般來說，在培養細菌時，需添加動物性營養物質，如蛋白胨等；而在培養霉菌時，一般需要添加植物性營養成分，如豆芽汁。下列相關敘述不正確的是（

）A．蛋白胨為細菌提供碳源、氮源和特殊營養物質B．細菌和霉菌體內的酶存在差異，導致二者偏好的營養成分不同C．分別培養細菌和霉菌時，需將培養基調節至相同的pHD．若需要比較細菌和霉菌形成的菌落差異，培養基中還需添加瓊脂3．如圖是老陳醋的生產流程，下列相關敘述正確的是（）A．蒸熟的高粱米應先加入大曲再冷卻B．“糖化”是將高粱中的淀粉等大分子氧化分解為小分子，為酒精發酵提供原料C．“醋醅”中含有的醋酸菌，是一種異養的單細胞真核生物D．“醋酸發酵”步驟中每天翻料兩次，可為醋酸菌提供更多氧氣4．下列關于細胞工程的說法正確的是（）A．體外培養的動物細胞形態相比體內正常細胞可能會發生改變B．作物脫毒苗培養時先誘導愈傷組織生根，再誘導生芽C．iPS細胞都是通過將外源基因導入體細胞獲得的D．離心法收集細胞只能用于傳代培養細胞的收集5．肝細胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突變會導致酪氨酸血癥。下圖是研究人員利用基因編輯技術糾正病人來源肝細胞，成功治療酪氨酸血癥小鼠的過程，為治療人類酪氨酸血癥奠定理論基礎。相關敘述準確的是（）A．酪氨酸血癥的發生說明基因能通過控制蛋白質的結構控制生物性狀B．過程②需在培養液中添加瓊脂、葡萄糖、干擾素動物血清等物質C．過程③需敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相關抗原基因D．基因編輯后的人源肝細胞植入小鼠分化為完整肝臟，是治療小鼠酪氨酸血癥的關鍵6．堿性磷酸酶是抗腫瘤藥物多柔比星前體的專一性活化酶，將堿性磷酸酶與單克隆抗體制成“生物導彈”，使多柔比星前體在腫瘤細胞處被活化，對其DNA造成損傷，抑制以DNA為模板進行的生理活動，達到治療腫瘤的目的。下列敘述正確的是（

）A．給小鼠注射多柔比星前體后，可從脾臟中得到能產生腫瘤抗體的B細胞B．制備單克隆抗體的過程中需用特定的選擇培養基和抗體檢測進行篩選C．“生物導彈”利用了堿性磷酸酶的定向制導作用和單克隆抗體的特異性殺傷能力D．多柔比星前體活化后可直接抑制腫瘤細胞的DNA復制和翻譯，而抑制其無限增殖7．下列關于動物細胞融合和單克隆抗體制備的敘述，錯誤的是（）A．滅活的病毒可與細胞質膜發生作用，從而誘導細胞融合B．用特定抗原免疫小鼠后；可從其骨髓中分離出漿細胞，用于細胞融合C．產生特定抗體的雜交瘤細胞可在小鼠體內培養，從腹水中提取抗體D．單克隆抗體可高度特異性地識別抗原，從而輔助腫瘤診斷8．黑曲霉多不耐高溫，發酵獲得檸檬酸的過程需大量冷卻水控制溫度，生產成本高。現利用原生質體融合技術獲得耐高溫高產黑曲霉，過程如圖所示。下列敘述正確的是（

）

A．處理①培養基中黃色圈大的菌落不一定為高產菌株B．處理②、③用纖維素酶和果膠酶去除細胞壁C．處理④升高溫度即可篩選出耐高溫高產黑曲霉D．發酵結束后通過適當的過濾、沉淀等方法獲得檸檬酸9．抗體一藥物偶聯物，也就是ADC，又被稱為“生物導彈”，由單克隆抗體、細胞毒性藥物以及兩者之間的連接物共3個部分組成。下列敘述正確的是（）A．該抗體一藥物偶聯物能識別腫瘤細胞上的各種膜蛋白性.B．經步驟①篩選得到的雜交瘤細胞具有的特點是能準確識別抗原的細微差異并能大量制備C．ADC起作用時會被細胞吞噬，并在溶酶體內被分解后釋放藥物D．誘導骨髓瘤細胞與脾臟中的細胞融合，可用的誘導因素只有滅活的病毒10．如圖是我國科學家培育克隆猴“中中”“華華”的過程，Kdm4d為組蛋白去甲基化酶基因、TSA為組蛋白脫乙酰酶抑制劑。下列說法錯誤的是（）A．各種動物胚胎移植的最佳時期不盡相同，一般是在原腸胚期前B．滅活的仙臺病毒可誘導體細胞和去核卵母細胞融合C．Kdm4d的mRNA和TSA的作用是對組蛋白進行表觀遺傳修飾來調控相關基因表達D．克隆猴和核供體所具有的微小差異來自基因突變或者染色體變異11．某小組通過PCR（假設引物長度為8個堿基，短于實際長度）獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切（如圖），再用所得片段與質粒連接成功構建了基因表達載體。下列敘述正確的是（

）A．其中一個引物序列為3'-TGCGCAGT-5'B．步驟①所用的酶是SpeI和CfoIC．用步驟①的酶對質粒進行酶切，至少獲得2個片段D．構建基因表達載體時需要使用限制酶和DNA聚合酶12．紫外線引發的DNA損傷，可通過“核苷酸切除修復（NER）”方式修復，機制如圖所示。著色性干皮癥（XP）患者的NER酶系統存在缺陷，受陽光照射后，皮膚易出現炎癥，進而發展成皮膚癌。下列敘述錯誤的是（）

A．圖中切口的產生應是限制酶的作用B．填補缺口時，新鏈合成以5'到3'的方向進行C．在DNA復制時可以進行缺口修復D．XP患者年齡增長，發生皮膚癌的可能性會下降13．科學家常利用λ-Red同源重組酶系統進行基因敲除。圖為科學家運用A-Red同源重組酶系統到大腸桿菌（E．coli）內進行靶基因敲除的過程，其中重組質粒pKD46在30℃時正常復制，而37℃時自動丟失。下列說法正確的是（）A．HA1和HA2分別添加在兩種引物的5'和3'端B．過程I和Ⅱ的培養溫度分別是30℃、37℃C．靶基因敲除過程，只發生磷酸二酯鍵的斷裂及合成D．若過程I是使用含青霉素的培養基成功篩選出含質粒pKD46的大腸桿菌，則說明該大腸桿菌自身含有青霉素抗性基因14．雙脫氧測序法（Sangtr法）是第一代DNA測序方法。在4支試管中分別加入4種dNTP和少量的1種ddNTP進行PCR，再把PCR產物變性，利用電泳進行分離，根據結果確定特定堿基的位置。通過該方法測定并比較某疾病患者與對照個體DNA模板鏈的一段堿基序列，結果如圖所示。下列敘述錯誤的是（

）

注：dNTP是PCR的四種原料；雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四種；在DNA聚合酶作用下，ddNTP與dNTP競爭核苷酸鏈延長位點，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為dATP，繼續延伸A．5'-TAGTGCCCATC-3'為對照個體的一段序列B．PCR過程中需要DNA聚合酶，不需要DNA解旋酶和DNA連接酶C．上述PCR反應體系中模板鏈需要足夠多D．患者該段序列中某位點的堿基C突變為T15．抗蟲和耐除草劑玉米“雙抗12-5”是我國自主研發的轉基因品種。在轉基因產品的研發、生產、銷售等環節，可采用PCR技術進行基因監測，為轉基因生物安全監管提供依據。下列敘述錯誤的是（

）A．PCR開始階段的預變性可使模板DNA變性更充分B．PCR循環過程中，復性的目的是使DNA聚合酶與模板相結合C．進行PCR基因監測時，應使用待檢目的基因的特征序列作為引物D．安全監管中，應阻止檢測出轉基因擴增產物的非轉基因標識農產品上市16．基因工程技術給人類生產生活和醫療帶來巨大的影響，下面有關說法正確的是（

）A．限制酶具有專一性，因此不同的限制酶不能產生相同的黏性末端B．在自然條件下，農桿菌轉化法不適用于將目的基因導入大多數的單子葉植物細胞C．只要有證據證明轉基因產品不安全，就應禁止轉基因技術的研究D．將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達的基因的調控元件重組在一起，導入哺乳動物的乳腺細胞，可獲得乳腺生物反應器17．隨著轉基因技術的發展，其安全性問題引發了極大的關注，下列敘述錯誤的是（

）A．轉基因農產品可能會引發過敏反應B．轉基因農作物中都含有會危害健康的毒性蛋白C．轉基因農作物可通過傳粉將轉入的基因擴散到其近緣物種中D．對轉基因安全性的爭議源于對基因結構、功能及調控機制了解有限18．CRISPR/Cas9基因編輯技術已被廣泛應用于基因治療等領域。其基本工具sgRNA/Cas9來源于原核細胞，包括具有導向功能的sgRNA和行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，技術原理如圖甲所示。回答下列問題：I.某研究團隊以人乳腺癌MDA-MB-231細胞、Lenti-CAS9-sgRNA質粒等為材料，進行原位定點敲除乳腺癌細胞中的人源粘著斑蛋白（VCL）基因，以研究該基因在細胞中的作用，為乳腺癌的治療提供理論