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文檔簡介

職業教育醫學生物技術專業教學資源庫實驗PCR擴增人谷胱甘肽轉移酶基因一、實驗原理

利用反應溫度的變化，在PCR反應體系共同存在的條件下，經過變性、退火、延伸三個過程的循環，耐熱TaqDNA聚合酶催化待擴增DNA合成的反應，以達到對靶序列的體外大量擴增。谷胱甘肽轉移酶是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒酶之一，其基因多態性（某位點發生堿基變化）的存在可引起其表達此酶的活性不同，導致解毒功能發生改變，從而增加特定腫瘤發病風險。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫二、實驗試劑（一）PCR擴增反應試劑1.模板DNA（10μg/mL）

以EDTA抗凝血為樣品，從中提取人類基因組DNA2.引物（10μmol/L）

上游引物序列：5’-GCAGCATGTGGCACCATCTC-3’

下游引物序列：5’-AGAGCCATGGACCCCCACAC-3’

預測擴增產物長度：420bp3.TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）4.dNTPs（2.5mmol/L）5.10×PCRbuffer6.雙蒸水職業教育醫學生物技術專業教學資源庫二、實驗試劑（二）PCR產物檢測試劑1.瓊脂糖（電泳級）：瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的濃度來控制，濃度越高孔徑越小。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫二、實驗試劑2.電泳緩沖液：維持電泳環境中溶液pH的穩定性，抑制核酸酶的活性，防止DNA的降解，有利于核酸分子的遷移。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫二、實驗試劑3.核酸熒光染料：EB（溴化乙錠：強致癌劑，操作時戴手套）或GelGreen，能特異結合核酸在紫外燈下發出熒光。4.上樣緩沖液（6×LoadingBuffer）：甘油可增加樣品密度，使其比重增加，確保樣品均勻沉入膠孔內；溴酚藍可以使樣品呈色，加樣操作更為方便，在電泳中呈現指示帶，可預測樣品電泳的速度和位置。5.DNAmarker（核酸分子量參照物）：根據擴增條帶的大小來選擇合適的DNAmarker。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫三、操作步驟（一）采血（二）提取人類白細胞基因組DNA（模板）（三）配制反應體系，在PCR反應管中配制反應體系，混勻并將離心至管底。（四）確定反應條件，在PCR儀上設置反應條件（五）擴增反應，將PCR反應管放入PCR儀中，啟動反應條件職業教育醫學生物技術專業教學資源庫職業教育醫學生物技術專業教學資源庫職業教育醫學生物技術專業教學資源庫三、操作步驟（六）電泳分析結果1.準備電泳緩沖液2.制膠：1.2%瓊脂糖，EB終濃度為0.5μg/mL，樣品孔置于負極端3.加樣：Marker和PCR擴增產物分別加到上樣孔內4.電泳：100V，30min5

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