職業教育醫學生物技術專業教學資源庫

三、下一代DNA測序技術

二、第一代DNA測序技術一、基本原理本章概要DNA的測序技術

四、第三代DNA測序技術職業教育醫學生物技術專業教學資源庫PacBioSMRT測序技術納米孔單分子測序技術0102第三代DNA測序技術第三代基因測序技術PacBioSMRT技術納米孔單分子測序技術基因測序第一代基因測序：Sanger測序采用的是直接測序法，Sanger測序目的是尋找與疾病有關的特定的基因突變。但是對于沒有明確候選基因或候選基因數量較多的大樣本病例篩查是難以完成的，而且其只能在PCR擴增后測序。而且只能逐段測序，分析單個DNA片段。測序成本高，數據分析量大，自動化程度不高。另外，此法，速度慢，時間長。

第二代基因測序第二代測序技術測序平臺和測序成本仍然十分高昂，儀器普遍高達40-70萬美元，而一個全基因組測序至少需要2000-5000美元，同時花費幾周的時間；第二代測序技術依賴于基因樣品的擴增過程，大量的洗脫過程即增加了成本和樣品制備的時間，也容易出現錯誤累積；第二代測序技術普遍讀長為150-400bp，無法滿足更高的科研需要；大量的數據拼接工作和光學讀取導致的大體量數據，讓分析變成了耗時耗力的工作。Better?PacBioSMRT測序技術PacificBiosciences公司研發的單分子實時測序系統（SingleMoleculeRealTime，SMRT）應用了邊合成邊測序的原理，并以SMRT芯片為測序載體。技術創新：零模波導孔（zero-modewaveguides,ZMWs）熒光標記在核苷酸焦磷酸鏈上高性能光學捕獲系統PacBioRS零模波導孔（zero-modewaveguides,ZMWs）ZMW，

是一個直徑只有10~50nm的孔，包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序，并實時檢測插入堿基的熒光信號。當激光打在ZMW底部時，只能照亮很小的區域，DNA聚合酶就被固定在這個區域。進行互補配對的dNTP停留在這個區域內的時間為ms，相比于它進入的時間us及未配對的dNTP進入和離開的時間長很多，因此，配對的堿基因其攜帶的熒光基團被激活發出較強熒光而被檢測到。檢測區內其它堿基因停留時間太短而熒光信號會很弱，未參入dNTP由于未進入檢測區而未被激發出熒光信號，因此大幅地降低了背景熒光干擾。熒光標記在核苷酸上的磷酸基團上完全模擬體內DNA自然合成，在下一個dNTP被添加到合成連之前，這個dNTP的磷酸基團會被釋放，熒光分子離開檢測區從而可消除背景噪音。高性能光學捕獲系統PacBioRSPacBioRS主要由一個大孔徑物鏡和四個單光子照相機來收集熒光所發射的光脈沖，使用一套優化的算法，將光學系統所捕獲的信息翻譯成ATGC堿基序列。PacBioSMRT測序原理1.

PacBioSMRT測序建庫2.聚合酶捕獲文庫DNA序列，錨定在零模波導孔底部3.4種不同熒光標記的dNTP隨機進入零模波導孔底部4.熒光dNTP與DNA模板的堿基匹配5.熒光dNTP被激光照射，發出熒光，檢測熒光6.酶反應過程中，使dNTP上的熒光基團脫落，在酶的

作用下合成一個堿基7.統計熒光信號存在時間長短，區分匹配堿基與游離堿基，獲得DNA序列。納米孔基因測序技術

納米孔基因測序技術英國牛津納米孔公司最新研發出第三代基因測序技術，這項新的基因測序技術采用納米孔單分子讀取技術工作原理對DNA進行生物或化學處理,而采用物理辦法直接讀出DNA序列.其原理可以簡單的描述為:電泳技術，借助電泳驅動單個分子逐一通過納米孔。單個堿基通過納米尺度的通道時,會引起通道電學性質的變化.理論上,A,C,G,T4種不同的堿基化學性質的差異會導致它們穿越納米孔時引起的電學參數的變化量也不同,對這些變化進行檢測可以得到相應堿基MinION的尺寸之小，只有一支筆的長度，重大約100克，MinION完全顛覆了測序儀的形象，MinION直接通過USB鏈接到筆記本上，原始的電流信號通過網絡傳到英國的服務器上，進行讀取。一個MinION有500個納米孔在并行測序，每個孔每秒測30bp，因此，要測到1G的數據，需要3天時間。

納米孔生物納米孔固體納米孔前言：DNA鏈的直徑非常小(雙鏈DNA直徑約為2nm,單鏈DNA直徑約為1nm),所以對所采用的納米孔的尺寸有著近乎苛刻的要求.納米通道(nanopore)是1999年由美國加州大學的Deamer和哈佛大學的Brant組共同提出的，是指由7聚體的a溶血素(aHL)在雙層脂膜上形成的直徑在(1．5～2．6)nm通道。左膜通道最窄處直徑尺寸約為1.5nm,恰好允許單鏈DNA分子通過,并且大小嚴格一致，從本質上說是一種離子通道．核酸外切酶附著在堿基表面將落入的孔的一側的外表面，而讓一種合成的環糊精作為傳感器共價結合到納米孔的內表面，將這個系統鑲嵌在一個脂質雙分子層內。為了提供既符合不同堿基檢測又滿足外切酶活性的物理條件，須事先將脂質雙分子層，調為不同的鹽濃度。在合適的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個堿基落入孔中，并與孔內的環糊精短暫作用，從而影響流過納米孔的電流。

固態納米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成,一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面鉆出納米尺度的孔洞,再進一步對孔的形狀和大小進行修飾而成.相比于生物納米孔,固態納米孔在穩定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的優勢,但是因為受限于如今的半導體工藝制造水平,固態納米孔的制造還較為復雜與昂貴.前提條件：（ⅰ)每個核苷酸都有其特有的電流阻塞信號;(ⅱ)納米孔具有合適的幾何尺寸,一次只容納一個堿基通過;(ⅲ)電流分辨率足以檢測核苷酸的移動;(ⅳ)核苷酸分子的運動必須是單向的;(ⅴ)納米孔與薄膜之間的組合應當足夠牢固以適應實驗所需的溫度和化學環境.薄膜將溶液分為2個區域,薄膜上的納米孔作為連接2個區域的導電通道.在薄膜的兩側加上偏置電壓,溶液中的離子在電壓作用下經過納米孔產生離子電流,在外部條件不變且無DNA分子通過納米孔的情況下,該電流是穩定的.DNA分子在驅動電壓作用下單向通過納米孔通道時,在合適的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個堿基落入孔中，并與孔內的環糊精短暫作用。由于堿基阻塞了通道導致流經納米孔通道的離子流量減小,因此可以觀察到離子電流的減小.離子電流可以通過偏置電壓乘以總電導的方式求得.腺嘌呤A與胸腺嘧啶T的電信號大小很接近，但T在環糊精停留的時間是其他核苷酸的2到3倍，鳥嘌呤G和胞嘧啶C各自停留的時間也不同，所以每個堿基都有特有的電流干擾振幅而區分開來。另外甲基化的c在環糊精的停留時間為正常c在環糊精的停留時間的兩倍，所以通過納米孔檢測還可以直接讀取甲基化的c

隧道電流對DNA分子經過電極時的位置、方向十分敏感,所以即使非常微小的差異也會引起隧道電流的變化,如何控制DNA分子準確、單一方向地通過納米孔也很難。電容檢測法作為一種可能的電學解決方案,也有研究者對此進行了研究,當單個堿基通過納米孔時,其自身所帶電荷會引起納米電容上的電荷量發生變化,從而可以檢測到電壓的變化,理論上4種不同的堿基所帶電荷不同,引起的電壓變壓也會有所差異,因此可以用于DNA的測序.實際在測量單個堿基過程中得到的電壓值會受到DNA骨架、附近堿基和溶液離子的影響,因此在堿基識別的準確度上還有很多需要研究的問題.

電容檢測法

熒光測序DNA序列信息轉換成兩種顏色的圖形信息，然后再通過光學讀出技術進行檢測、分析。于是人們開發出了一種新的方法，使用合成DNA和光讀取技術測序。待測DNA鏈中的每一個核苷酸都被替換成更長的由橙色和藍色堿基組成的寡聚體，每一個待測核苷酸都被12bp的寡聚體替代。同時，通過這種信號轉化還將DNA鏈中原本的四種信號A、T、G、C簡化成了A、B兩種信號。

缺陷

1，DNA高速通過納米孔的特性使得高速測序成為可能，但同時這種高速度也正是很多納米孔測序技術的弱點。因為速度太快，檢測的信號質量就不高，甚至很多小的信號根本就檢測不到。當DNA在電泳作用下通過納米孔時，由于擴散作用的影響，降低了測序的質量。鑒于此，對于納米孔測序技術來說，最為重要的一點就是如何控制并減慢DNA分子通過納米孔的速度，同時盡量消除由于納米孔表面相互作用給DNA分子跨孔動力學上造成的波動現象。降溫和增加溶液的粘稠度可以在一定程度上減慢DNA分子通過納米孔的速度，但這兩種方法都不能消除因納米孔表面相互作用造成的跨孔動力學波動現象。2，溶血素七聚體是最常用于在脂質雙分子層中制造生物納米孔的材料，它性質非常穩定。但脂質雙分子層的性質卻不那么穩定，尤其是液態脂質雙分子層，制造起來極難且費時。金屬氧化物等介質上“制作出”穩定的、有功能的固態納米孔制作工藝非常繁瑣，速度慢又耗費人力，而且制作出的產品還常常無法達到應用的要求。總結盡管離納米測序完全投入商業化還有一段距離，但是我們可以預見，一旦其技術條件完全成熟，為人類的基因測序帶來的改變是巨大的。納米孔測序技術在成本、速度等方面有著十分巨大的優勢