畜禽養殖糞污中典型致病菌檢測三重數字Detectionoftypicalpathogenicbacteriainlivest2024-07-01發布2024-09-01實施天津市市場監督管理委員會發布IDB12/T1328—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由天津市農業農村委員會提出并歸口。本文件起草單位：農業農村部環境保護科研監測所、天津市動物疫病預防控制中心、新疆農墾科學院、天津市農業科學院。本文件主要起草人：杜連柱、程深偉、張克強、梁雨、王健春、尹春博、劉福元、郜興亮、楊井泉、蘇蔡。1DB12/T1328—2024畜禽養殖糞污中典型致病菌檢測三重數字PCR法本文件規定了畜禽養殖糞污中典型致病菌的三重數字PCR檢測方法的原理、試劑和材料、儀器設備、操作步驟、結果分析與表述及生物安全措施。本文件適用于天津市畜禽養殖糞污中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7、沙門氏菌的快速定量檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682—2008分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489—2008實驗室生物安全通用要求GB/T25171—2023畜禽養殖環境與廢棄物管理術語GB/T27403—2008實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測GB/T27522—2023畜禽養殖污水監測技術規范SN/T4853轉基因大米定量檢測數字PCR法SN/T5334.1—2020轉基因植物產品的數字PCR檢測方法第1部分：通用要求與定義3術語和定義GB/T25171—2023、SN/T5334.1—2020界定的術語和定義適用于本文件。微滴式數字PCR系統采用毛細通道網格將數萬個微滴離散進入2D芯片，從而有效地實現反應體系的精準分割。該系統利用金黃色葡萄球菌的nue、大腸埃希氏菌0157:H7的rfbE以及沙門氏菌的Fiml特異性基因序列對畜禽養殖糞污中典型致病菌進行檢測。在PCR擴增后，通過泊松分布校正陽性微滴的數量和比例，可以準確計算靶基因序列的起始拷貝數或濃度，從而同時實現對三種病原體的快速定量檢測。5儀器和設備所需儀器和設備如下：a)微滴生成系統；b)PCR儀；c)微滴閱讀分析系統；d)高速冷凍離心機：控溫4℃~8℃,離心力不小于12000g/min;e)分析天平：精度0.01g;2DB12/T1328—2024f)恒溫水浴箱：95℃±1℃;g)濕熱高壓蒸汽滅菌器；h)恒溫振蕩搖床：控溫28℃±1℃~37℃±1℃,轉速在125r/min~250r/min;i)生物安全柜；j)組織研磨儀；k)冰箱：控溫0℃~4℃;1)超低溫冰箱：控溫-20℃~-80℃;m)微量移液器：0.5μL~10μL,20μL~200μL,100μL~1000μL;n)超微量紫外分光光度計；o)無菌離心管：1.5mL,15mL,50mL。6試劑和材料6.1除另有規定外，所有試劑均為分析純。實驗用水應符合GB/T6682—2008規定的一級水。6.2所需試劑和材料如下：a)5×dPCR預混液；c)裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨),100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane,三羥甲基氨基甲烷),1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸),用HCl調至pH8.0;d)無水乙醇；f)DNAoff防核酸污染用劑；g)熒光素鈉鹽。6.3引物和探針6.3.1金黃色葡萄球菌nuc基因引物和探針nuc上游引物：5'-CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3'nuc下游引物：5'-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACT-3'nuc探針：5'-(HEX)-TGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG-(BHQ1)-3'6.3.2大腸埃希氏菌0157:H7rfbE基因引物和探針rfbE上游引物：5'-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3'rfbE下游引物：5'-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3'rfbE探針：5'-(CY5)-AATAAATTTGCGGAACAAAACCATGTGCAA-(BHQ3)-3'6.3.3沙門氏菌的FimY基因引物和探針FimY上游引物：5'-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3'FimY下游引物：5'-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3'FimY探針：5'-(FAM)-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-(BHQ1)-3'7操作步驟3DB12/T1328—20247.1采樣物品采樣容器應經121℃、20min高壓滅菌或使用一次性無菌器具。其余采用所用工具、文具和安全防護用品等應按照GB/T27522—2023中第7章規定執行。7.2采樣方法參照GB/T36197進行畜禽養殖糞污樣品的采集。7.3樣品運輸與保存樣品在運輸過程中應4℃以下保存并及時送達實驗室檢測。如當日送樣不能及時檢測，應將樣品放入0℃~4℃冰箱保存，放置時間不超過24h。若長期保存，應放置于-80℃凍存。保存期間避免反復凍融。7.4DNA的制備按照7.1-7.3采集的畜禽養殖糞污，稱取3.0g,加入到含有5mL裂解液的15mL無菌離心管中，并使用組織研磨儀充分混勻。將離心管移至95℃恒溫水浴鍋中孵育15min,孵育期間振蕩2次~3次。12000g/min,4℃~8℃低溫離心10min,轉移上清液至新的離心管中。加入等體積氯仿，混勻后，12000g/min,4℃~8℃低溫離心5min。吸取上清至新的無菌離心管中，加入0.6倍體積預冷的異丙醇，混勻。12000g/min,4℃~8℃低溫離心5min,輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，吸干液體。加入500μL75%乙醇，顛倒洗滌，12000g/min,4℃~8℃低溫離心5min棄去上清，晾干。沉淀溶于20μL一級水中，保存在-20℃備用。陽性對照樣品也應采取上述DNA制備形式。整體操作步驟也可以使用等效商品化DNA提取試劑盒并按其說明書制備模板DNA。7.5DNA濃度的測量DNA濃度的測量方法和對DNA模板濃度的要求應符合SN/T4853的規定。7.6三重數字PCR反應體系在試劑配制區進行ddPCR體系配置。畜禽養殖糞污中同時檢測金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7、沙門氏菌的三重數字PCR檢測體系見表1(25μL反應體系):表1數字PCR反應體系試劑成分體積(μL)5×dPCR預混液nuc上游引物(10μmol/L)nuc下游引物(10μmol/L)nuc探針(10μmol/L)0.5rfbE上游引物(10μmol/L)rfbE下游引物(10μmol/L)rfbE探針(10μmol/L)0.5FimY上游引物(10μmol/L)4DB12/T1328—2024FimY下游引物(10μmol/L)FimY探針(10μmol/L)0.5DNA模板(1~100ng/μL)一級水熒光素鈉鹽(1μmol/L)2.57.7對照和平行每次檢測應設置空白對照和陽性對照。空白對照(陰性對照)用一級水替代樣品DNA。陽性對照采用陽性質粒標準品。每個待檢樣品提取的DNA溶液以及空白和陽性對照都應進行3個平行樣本的檢測。陽性標準品：含有金黃色葡萄球菌nuc基因、大腸埃希氏菌rfbE基因和沙門氏菌FimY基因的質粒標準品。也可使用自行提取的陽性標準菌株核酸。7.8微滴生成和PCR反應在樣本制備區進行，利用微滴生成擴增系統完成25μL反應體系分割和PCR反應。反應條件：95℃,5min,1個循環；95℃,15s,60℃,1min,45個循環；98℃,5min,1個循環；4℃保存反應產物。整體反應期間升降溫度速度均為1℃/s。7.9微滴讀數利用微滴閱讀分析系統對數字PCR反應進行熒光信息采集和分析。8結果分析與表述8.1閾值設定根據數字PCR結果中陰性分割體系的終點熒光值設定熒光的閾值限。閾值限需要對陰性和陽性擴增結果進行明顯的區分。8.2質量控制同時滿足以下條件，實驗為有效：a)數字PCR有效分割體系數不低于理論分割體系數的60%;b)空白對照(陰性對照):三個通道(分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7和腸炎沙門氏菌)均無擴增，擴增終點熒光信號小于閾值，且每個通道的陽性微滴數<1;c)陽性對照：三個通道(分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7和腸炎沙門氏菌)有明顯的擴增，擴增終點熒光信號大于閾值，且每個通道的陽性微滴數都≥1;d)每份樣品的3個平行重復檢測結果相對標準偏差不超過25%。8.3結果換算樣品典型致病菌濃度換算見公式(1):5…………(1)C——畜禽糞污樣品中某一典型致病菌含量(拷貝數/mL);Nmean——25μL反應體系中測得核酸拷貝值的平均值(拷貝數);V?——提取DNA的終體積(μL);V?——ddPCR反應體系中加入的DNA模板體積(μL);V?——提取DNA時吸取的樣品體積(mL);d——用于提取畜禽糞污DNA樣品的稀釋倍數，如樣品稀釋10倍則為10?1;M——DNA模板的稀釋倍數8.4結果判斷樣品FAM通道(沙門氏菌)未得到擴增，擴增終點熒光信號小于閾值，判定樣品檢測結果為陰性，報告未檢出沙門氏菌。樣品FAM通道得到擴增，擴增終點熒光信號大于閾值，判定樣品檢測結果為陽性，報告檢出沙門氏菌核酸。根據公式(1)計算樣品中沙門氏菌含量，報告為XXX拷貝數/mL。樣品HEX通道(金黃色葡萄球菌)未得到擴增，擴增終點熒光信號小于閾值，判定樣品檢測結果為陰性，報告未檢出金黃色葡萄球菌。樣品HEX通道得到擴增，擴增終點熒光信號大于閾值，判定樣品檢測結果為陽性，報告檢出金黃色葡萄球菌。根據公式(1)計算樣品中金黃色葡萄球菌含量，報告為XXX拷貝數/mL。樣品CY5通道(大腸埃希氏菌0157:H7)未得到擴增，擴增終點熒光信號小于閾值，判定樣品檢測結果為陰性，報告未檢出大腸埃希氏菌0157:H7。樣品CY5通道得到擴增，擴增終點熒光信號大于閾值，判定樣品檢測結果為陽性，報告檢出大腸埃希氏菌0157:H7核酸。根據(1)計算樣品中大腸埃希氏菌0157:H7含量，報告為XXX拷貝數/mL。9生物安全措施檢測過程中防止交叉污染的措施應按照GB/T27403—2008中附錄D的規定執行。應由具備資格的工作人員進行檢測，并按照GB19489中的相關規定執行。與樣品接觸過的容器和廢棄物經121℃高壓滅菌20min進行無害化處理。10定量限和檢出限三重微滴式數字PCR檢測三種致病菌的定量方法檢測限分別為：沙門氏菌6.97c