DB51/T1097—2010牛奶中沙丁胺醇殘留檢測方法一酶聯免疫吸附測定(ELISA)法2010-06-01發布2010-07-01實施I前言 錯誤!未定義書簽。1范圍 12規范性引用文件 13制樣 14測定方法 15檢測方法靈敏度、準確度、精密度 3本標準由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標準由四川省質量技術監督局批準。本標準起草單位：四川省獸藥監察所、四川省獸藥殘留監控中心。本標準主要起草人：吳曉嵐、程江、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艷麗、王海波。1牛奶中沙丁胺醇殘留檢測方法一本標準規定了牛奶中沙丁胺醇殘留量的制樣和快速檢測—酶聯免疫吸附測定方法。2規范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規則和實驗方法3制樣取新鮮或解凍的空白或供試牛奶，渦旋混合使之均勻，密封。3.2樣品的保存-20℃以下冰箱中貯存備用。4測定方法4.1方法提要和原理牛奶中殘留的沙丁胺醇用乙腈提取，酶聯免疫吸附測定法檢測。其基本原理是抗原抗體反應。酶標板的微孔包被有偶聯抗原，標樣或樣品中的沙丁胺醇和微孔條上預包被的偶連抗原競爭特異性抗體。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結合的酶標記抗原。加入底物液，結合到板上的酶標記物將底物轉化為有較即可得出沙丁胺醇殘留含量。4.2試劑和材料以下所有試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682規定的二級水。4.2.2沙丁胺醇檢測試劑盒：2℃~8℃保存。(采用官方備案的試劑盒)。4.2.2.196孔板酶標板8條×12孔，包被有沙丁胺醇偶聯抗原。4.2.2.2沙丁胺醇系列標準溶液0μg/L、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L。4.2.2.3酶標二抗。4.2.2.4抗體工作液。4.2.2.5底物溶液A。4.2.2.6底物溶液B。4.2.2.7濃縮洗滌液臨用前用水稀釋二十倍作為洗滌液。2DB51/T1097—20104.2.2.9終止溶4.3.3g4.3.5振蕩器4.3.9微量移液器單道50μL,100μL,1000μL多道50μL-250μL試料的制備包括：——取制備后的供試樣品，作為供試試料；——取制備后的空白樣品，作為空白試料；——取制備后空白樣品，添加適宜濃度的標準溶液作為空白添加試料。乙腈，振搖10min,于3000r/min15℃離心稀釋后的復溶工作液渦動1min,取50μL水相用于分析。4.4.4樣品測定程序(20℃~25℃條件下操作)以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的酶標板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2℃~8℃。將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做兩個平行實驗。標準溶液或試樣溶液到微孔底部，每孔再加入50μL沙丁胺醇抗體溶液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25℃避光環境中反應30min。4.4.4.3倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。每孔加入250μL洗滌液，10s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。4.4.4.4加入100μL酶標二抗到微孔底部，用蓋板膜封板，25℃避光環境中反應30min。取出酶標板，4.4.4.5加入50μL底物溶液A和50μL底物溶液B到微孔中，輕輕振蕩混勻25℃避光環境顯色15min。4.4.4.6加入50μL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處，測定每孔吸光度值(OD所獲得的標準或樣品吸光度值的平均值除以第一個標準(0標準)吸光度值的平均值再乘以100%,………B—為標準溶液或供試樣品的平均吸光度值；3B?—為零濃度標準溶液的平均吸光度值。以X軸為標準溶液中沙丁胺醇濃度(μg/L)的自然對數，Y軸為百分吸光度值，在半對數坐標紙上繪制標準曲線圖。相對應的供試樣品的濃度(μg/L)可以從標準曲線上查出。也可以求出回歸曲線的方程，計算未知樣品中沙丁胺醇的濃度。如果有專業計算機軟件可直接求出供試樣中沙丁胺醇的濃度。注：檢測結果小于5.0μg/L時，可判為未檢出，大于5.0μg/L時，判為可疑，需用確證法確認。5檢測方法靈敏度、準確度、精密度5.1靈敏度本