實驗五層析技術

孫啟明

2014-10-22層析法的定義和基本原理

定義：層析法又稱色譜法（Chromatography），是廣泛應用的一種生物化學技術，層析法是利用混合物各組分物理化學性質（如溶解度、吸附能力、電荷和分子量等）的差別，使各組分在支持物上集中分布在不同區域；借此將各組分分離。

原理：層析利用兩個相，一個相稱為固定相；另一個相稱為流動相。由于各組分受固定相的阻力和受流動相的推力影響不同，各組分移動速度各異，從而使各組得到分離。層析法的分類分類：層析法有多種類型，液體作為流動相的稱為液相層析，氣體作為流動相稱為氣相層析。1．按兩相所處的狀態分類：色譜中有兩相，即流動相和固定相。流動相可以是氣體或液體，固定相可分為固體吸附劑和涂在固體擔體或毛細管內壁上的液體固定相。（1）氣相色譜法：用氣體作流動相的色譜法。再按固定相的狀態，氣相色譜又可分為氣固色譜和氣液色譜（2）液相色譜法：用液體作流動相的色譜法。再按固定相的狀態，液相色譜亦可分為液固色譜和液液色譜2．按固定相的使用形式分類：可分為柱層析、紙層析和薄層層析。紙層析和薄層層析屬于平面層析。（1）柱層析：固定相裝在玻璃管或金屬管內，或涂在柱內壁上。又分為填充柱色譜和空心毛細管色譜。層析時在柱頂部加入要分離的樣品溶液，假如樣品內含兩種成分A與B，樣品溶液全部流入吸附柱之后，加入合適的溶劑洗脫，A與B也就隨著溶劑向下流動而移動，最后達到分離。連續分段收集洗脫液，各成分即可順序洗出。（2）紙層析：用濾紙作載體，吸附在濾紙上的水為固定相,溶劑為液相，試樣溶液在紙上進行展開、分離。（3）薄層層析：將固定相(吸附劑粉末)均勻地涂鋪在玻璃板上或塑料板上，樣品的展開、分離在其上進行。薄層層析法是將吸附劑在玻璃板上或其它薄膜上均勻地鋪成薄層，把要分析的樣品加到薄層上，然后用合適的溶劑展開，而達到分離鑒定的目的。優點是設備簡單，操作容易，層析展開時間短，分離效率高，并可采用腐蝕性顯色劑，而且可以在高溫下顯色。3．按層析過程的機理不同，層析法可以分為下列幾種類型：①吸附層析②分配層析③離子交換層析④凝膠層析⑤親和層析。實驗內容（1）紙層析－轉氨基作用的驗證（2）薄層層析－脂類的分離（3）離子交換層析－混合氨基酸分離凝膠層析（4）血紅蛋白和DNP－魚精蛋白分離（不要求）紙層析法－轉氨基作用驗證【基本原理】體內α-氨基酸的α-氨基在氨基轉移酶的作用下，移換至α-酮酸的過程，稱氨基移換作用。此類酶各有一定的特異性，普遍存在于動物各組織中。本實驗是將谷氨酸與丙酮酸在肝勻漿中的谷氨酸-丙酮酸氨基轉移酶(簡稱谷-丙轉氨酶)的作用下進行氨基移換反應，然后用紙層析法檢查反應體系中丙氨酸的生成。其反應過程如下：轉氨基作用由于谷氨酸、丙酮酸在肝勻漿中可循其他代謝途徑分解和轉化，影響氨基移換過程的觀察，因此在反應體系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代謝過程。【紙層析法－轉氨基作用驗證操作步驟】

一、肝勻漿的制備取小白鼠1只，頸椎脫臼法處死后，取出肝臟，經0.9%NaCl溶液洗去血污后，稱取肝臟約1g，置研缽中加入玻璃砂少許(或用玻璃勻漿器研磨)，然后加0.01mol/L，pH=7.4磷酸緩沖溶液1ml磨成勻漿，之后再加入4ml磷酸緩沖液。二、轉氨酶反應1．取短玻璃管2只編號(1、2)，各加肝勻漿10滴，先將2號管置沸水浴中5分鐘（酶滅活對照管）。2．兩管各加1%谷氨酸鉀溶液10滴，1%丙酮酸鈉溶液10滴，0.25%一碘醋酸鉀溶液5滴，同置40℃水浴中保溫30分鐘。3．取出，向兩管各加5%HAc溶液2滴，再同置沸水浴中5分鐘，冷卻后各取0.5ml反應溶液離心(2000r/min，5min)，將上清液移入另外同樣編號的塑料離心管中備用。三、層析驗證1．在10cm×20cm濾紙上，距短邊2.5cm處用鉛筆輕輕畫一線(原線)，在原線上，每隔1.5cm處用鉛筆作記號，并在線下底邊注明1、2、谷氨酸、丙氨酸記號。2．用毛細管分別吸取1號液、2號液在層析濾紙上點樣，注意斑點不可太大，一般直徑約0.3cm為宜，約5min等干后，在1、2號原點上，再重復點兩次次(注意，不可調錯)，然后分別點上谷氨酸、丙氨酸，作為對照，干后置層析缸中展開1.5～2h。注意：點樣處切勿浸入展開劑中。3．取出濾紙晾干，噴以0.1%茚三酮乙醇溶液，電吹風吹干，觀察層析出現的斑點并解釋之。12GluAla紙上層可折疊一下以便懸掛2.5cm點樣處勿浸入展開劑中玻璃缸上沿掛繩，折疊濾紙掛在繩上，不同小組濾紙不要有接觸薄層層析分離脂類【基本原理】薄層層析法是將固定相支持物均勻地鋪在玻璃板上成為薄層，然后將要分析的樣品點加到薄層上，用合適的溶劑展開而達到分離的目的。常用的固相支持物有硅膠、氧化鋁、硅藻土、氫氧化鈣、磷酸鈣等；本實驗以硅膠G作固定相。脂類硅膠薄層層析的基本原理主要是通過硅膠對不同的脂類物質具有不同的吸附能力。在展開劑（移動相）展開過程中脂類物質在兩相之間重復進行吸附-解吸-再吸附-再解吸,使各種脂類物質隨展開劑移行，結果，與固定相（硅膠）吸附能力弱的和/或在移動相中溶解度大的脂類物質隨展開劑移行到較遠的距離，而與固定相吸附能力強的和/或在移動相中溶解度小的脂類物質，在展開過程中移行慢，落在后面，這樣展開一段時間后就可以將各種脂類物質彼此分離開來。薄層層析的優點是設備簡單易行、展開時間短、分離迅速、樣品用量小、靈敏度高、分離時幾乎不受溫度的影響，甚至不受腐蝕性顯色劑影響，可以在高溫下顯色，分離效率高。薄層層析是一項常用的分離、鑒定脂類的技術。在脂類薄層層析中通常用硅膠G作為支持劑，可選用石油醚、四氯化碳、氯仿等作為展開劑。本實驗用石油醚-丁酮-乙酸混合溶劑作展開劑。【薄層層析分離脂類操作步驟】1．層析薄板的制作：稱取硅膠G2g置研缽中加入0.3%羧甲基纖維素8mL，研勻后迅速倒在8cm×12cm玻片上，水平放置，可用杵稍加涂抹使硅膠在玻璃上分布均勻，放置到硅膠凝固后，置100℃烘箱中烘干備用（放到實驗臺里面,平放,防止打翻或碰壞）。2．點樣：分別用毛細玻管吸取各種脂質的標準液（3種）及試樣（2種），在薄板的一端1.5cm高度處取間距為1cm點樣三次，待溶劑蒸發后置于盛有展開劑的標本缸中，點樣一端起點以下，浸入展開劑中。注意：點樣處切勿浸入展開劑中。3．顯色：約半小時后，當展開劑上升至適當高度（接近薄板上端，不要跑完薄板），將薄板取出電吹風吹干，噴以磷鉬酸顯色劑，再次吹干。比較各種脂質和試樣所顯斑點位置，作圖記錄之，計算Rf值，即斑點中心至原點的距離（cm）／展開劑擴展前沿至原點的距離（cm）。可在玻璃板背后劃線標記點樣處，不要在硅膠上劃線破壞硅膠層1.5cm離子交換層析分離混合氨基酸【基本原理】離子交換層析是利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質中被分離的各種離子間的親和力的不同，經過交換平衡達到分離目的的一種柱層析法。氨基酸是兩性電解質，每一種氨基酸都有它特定的等電點，各種氨基酸在pH小于其等電點的溶液中以陽離子的形式存在，可以與陽離子交換劑進行交換，再慢慢增大洗脫液的pH，氨基酸將依照其等電點由小到大的順序逐漸洗脫，此時分部收集各洗脫組分，即可將各種氨基酸一一分離。本實驗以天冬氨酸和精氨酸為例，利用磺酸型陽離子交換樹脂將其從混合物中分離。天冬氨酸是酸性氨基酸，pI=2.98；精氨酸是堿性氨基酸，pI=10.76。根據其等電點，我們選擇0.1M檸檬酸緩沖液（pH2.2），將它們都吸附在陽離子交換劑上，再用0.1M檸檬酸緩沖液（pH5.0）洗脫天冬氨酸，用0.1MNaOH溶液洗脫精氨酸。離子交換層析的基本原理示意圖++++———++++++++++—+++【操作步驟】1．裝柱：取加入填料的層析柱一支，夾好“再”形夾，用鐵絲將樹脂懸液攪勻，使樹脂內不殘留氣泡，樹脂自由沉降后打開“再”形夾，緩慢放出液體，當液面慢慢降至樹脂面時，關閉下端“再”形夾。（注意在整個操作過程中，應防止液面低于樹脂面，當液面低于樹脂面時，空氣進入樹脂內形成氣泡)2.洗柱：用0.1M，pH2.2檸檬酸緩沖液2ml洗柱，同時調整流速為5滴/min（20滴為1ml）3.加樣：將混合氨基酸溶液0.2ml沿層析柱內壁緩緩加入，打開“再”形夾，使樣品液緩緩流進柱床，流速為5滴/min。樣品全部進入柱床后，用0.1M，pH2.2檸檬酸緩沖液2ml，分兩次先后加入洗柱。4．洗脫及分段收集：用0.1M，pH5.0檸檬酸緩沖液洗脫，邊加洗脫液邊收集，并調節流速至10滴/min，每管收集1ml。所有收集管分次用茚三酮反應檢測氨基酸。5．顯色：待第一個氨基酸被洗脫后，（茚三酮反應檢測連續兩管呈陰性），立即改用0.1MNaOH以同樣流速及收集體積洗脫，并對各管收集液進行氨基酸檢測。1ml洗脫液+0.2%茚三酮溶液1ml+0.5M，pH5.0檸檬酸緩沖液1ml水浴中10min，溶液顯蘭紫色者為氨基酸陽性反應混勻1ml洗脫液+酸性茚三酮溶液1ml+0.5M，pH5.0檸檬酸緩沖液1ml水浴中10min，溶液顯蘭紫色者為氨基酸陽性反應混勻注意要點紙層析及薄層層析離心前用天平平衡兩根試管點樣三次，毛細管末端如果有破裂點樣會有困難

點樣處勿進入展開劑中不同組的層析板或紙不要有接觸展開劑及顯色劑不要弄混！！離子交換層析先檢查連接柱子的橡皮管是否有粘連樹脂內不要留有氣泡樹脂上層液面要高于樹脂避免氣泡進入茚三酮反應檢測連續兩管呈陰性才為洗脫干凈清洗小試管兩支，大試管三十支凝膠層析法分離血紅蛋白和DNP－魚精蛋白

【基本原理】凝膠層析法是利用凝膠把分子大小不同的物質分離開的一種方法。血紅蛋白的分子量為67，000；魚精蛋白的分子量為1，000–5，000，利用凝膠層析法可以將它們從混合物中分離開。根據被分離物質分子量，我們選擇的凝膠是SephadexG–50，它的分子量適用范圍為1，500～30，000。所以，血紅蛋白不能進入凝膠內部，隨洗脫液直接流出，魚精蛋白分子量較小，可以進入凝膠內部，它的流經途徑較長，較后流出層析柱。血紅蛋白本身有紅色，魚精蛋白無色，故將黃色的DNP（2，4–二硝基氟苯）偶聯于魚精蛋白，使其著色，便于觀察。【操作步驟】

1．樣品制備臨上樣前，將0.3ml血紅蛋白溶液和0.5mlDNP–魚精蛋白溶液混勻即可。2．加樣與洗脫切斷洗脫液，當層析柱中液面下降與凝膠表層平齊時，即用滴管將樣品液緩緩沿柱壁加入，不使凝膠表層擾動，待樣品液面與凝膠表層平齊時，再加少許蒸餾水，并連通洗脫液，開始洗脫。注意觀察