乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理乙酰輔酶A羧化酶（AcetylCoACarboxylase，ACC）在生物體內催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產物合成的關鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。CheKine?乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動植物組織，細菌和細胞、血清或血漿等生物樣本。在該試劑盒中，ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無機磷，通過鉬酸銨定磷法測定無機磷的增加量來測定ACC活性。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測660nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：臨用前配制；48T加入5mLReagentⅠ，96T加入10mLReagentⅠ，充分溶解，4℃避光保存可穩定1個月。ReagentIII：臨用前配制；48T加入4mL去離子水，96T加入8mL去離子水，充分溶解，用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復凍融。ReagentIV：臨用前配制；48T加入5mL去離子水，96T加入10mL去離子水，充分溶解，4℃避光保存可穩定1周。ReagentV：臨用前配制；48T加入5mL去離子水，96T加入10mL去離子水，充分溶解，4℃避光保存可穩定1周。ReagentVI：即用型；室溫保存。注意：ExtractionBuffer有毒且有刺激性氣味，ReagentVI具有腐蝕性，建議在通風櫥進行實驗。WorkingReagent：按去離子水：ReagentIV：ReagentV：ReagentVI=2：1：1：1的比例配制，現用現配。Standard：即用型；10μmol/mL標準磷貯備液，使用前，平衡到室溫。4℃保存。0.5μmol/mLStandard：取50μLStandard加950μL去離子水，充分混勻。注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應控制解凍的溫度和時間。室溫環境下解凍時，需在4h內完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細菌和細胞：收集500萬細菌或細胞到離心管內，用冷PBS清洗細菌或細胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細菌或細胞30次（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調節波長到660nm，可見光分光光度計用去離子水調零。將ReagentⅠ、II、III在37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）預熱10min。操作表（下述操作在1.5mL離心管中操作）：試劑空白孔（μL）標準孔（μL）測定孔（μL）對照孔（μL）樣本001010ReagentⅠ00090ReagentII00500ReagentIII0040037℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）準確反應30min后，90℃滅活5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10,000g，25℃離心5min，取上清。以下操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作：上清液0020200.5μmol/mLStandard02000去離子水20000WorkingReagent180180180180充分混勻，37℃(哺乳動物)或25℃（其它物種）孵育30min后，冷卻至室溫，記錄660nm處吸光值，空白孔記為A空白，標準孔記為A標準，測定孔記為A測定，對照孔記為A對照。計算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白。注意：空白管和標準管只需做1-2次，每個測定管需要設一個對照管。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA測定小于0.04可適當加大樣本量。如果ΔA測定大于1.5，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們為您提供的計算公式，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。ACC活性的計算按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：每毫克蛋白每小時產生1μmol無機磷的量定義為一個酶活力單位。ACC(U/mgprot)=C標準×ΔA測定÷ΔA標準×V反總÷(V樣×Cpr)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：每克樣本每小時產生1μmol無機磷的量定義為一個酶活力單位。ACC(U/g鮮重)=C標準×ΔA測定÷ΔA標準×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標準÷W按照細菌或細胞數量計算酶活單位定義：每104個細菌或細胞每小時產生1μmol無機磷的量定義為一個酶活力單位。ACC(U/104)=C標準×ΔA測定÷ΔA標準×V反總÷(n×V樣÷V樣總)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標準÷n按樣本體積計算：酶活單位定義：每毫升液體每小時產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。ACC(U/mL)=C標準×ΔA測定÷ΔA標準×V反總÷(V樣÷V樣總)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標準C標準：標準溶液的濃度，0.5μmol/mL；V反總：反應體系總體積，0.1mL；V樣：加入的樣本體積，0.01mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，30min=0.5h；n：細菌或細胞數量，以萬計；W：樣本質量，g。注意事項配制WorkingReagent最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。配好的WorkingReagent應為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染。顯色結束后應立即檢測，最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。結果展示以下數據僅供參考，實驗者需根據自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定小鼠腦和煙草葉