飼料中構(gòu)巢曲霉測(cè)定實(shí)時(shí)熒光PCR方法2014-02-28發(fā)布2014-04-30實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、國(guó)家農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、中華人民共和國(guó)吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：史艷宇、劉金華、王瑩、郎樂、張慶波、韓冰雪、李媛媛、王慶峰。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義4原理5試劑a)上游引物：5'-GGCTACACCGAGGACGACAT-3’b)下游引物：5'-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3’2脫氧鳥苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脫氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸)。5.4真菌基因組DNA提取純化試劑盒。5.510×PCR緩沖液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化鉀(KC1),15mmol/L氯6.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.11渦旋混合器6.12實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管。7.2DNA提取3——Ct值≥40.0,可判定樣品實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果為陰性，可直接報(bào)告未檢出構(gòu)巢曲霉；——Ct值≤35.0,可判定樣品實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果為陽(yáng)性，按附錄A進(jìn)行確證。確證試驗(yàn)結(jié)果為構(gòu)9生物安全措施410.1檢驗(yàn)過程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。10.2檢驗(yàn)過程中防止交叉污染的措施按照GB/5A.1.1顯微鏡：10×~100×。A.1.5放大鏡。A.2試劑苯酚10g,乳酸(密度1.21kg/m3)10g,甘油20g,蒸餾水10mL。將苯酚在水中加熱溶解，然后A.3.1制片取載玻片加乳酸-苯酚液一滴，用接種針取一小塊霉菌培養(yǎng)物(盡量是純培養(yǎng)物),置乳酸-苯酚液A.3.2鏡檢A.3.3構(gòu)巢曲霉形態(tài)特征小梗雙層，梗基(5μm~6μm)×(2μm~3μm),小梗(5μm~6μm)6粗糙，直徑3μm~3.5μm。閉囊殼球形，暗紫紅色，直徑135μm~150μm。子囊孢子雙凸鏡形，紫紅色，約5μm×4μm,有兩個(gè)雞冠狀突起。閉囊殼外面包圍著一層殼細(xì)胞，淡黃色，球形，壁厚，直徑約25μm