第一章發(fā)酵工程第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術及應用一、微生物的基本培養(yǎng)技術1.研究和應用微生物的前提（即發(fā)酵工程的重要基礎）：防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養(yǎng)物。（P9）2.在實驗室培養(yǎng)微生物的要求：(1)為微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件(培養(yǎng)基）。(2)要確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來（無菌技術）。（P9）（一）培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。（P9）2.培養(yǎng)基作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。（P9）3．培養(yǎng)基的分類（按照物理性質分類）（P9）（1）液體培養(yǎng)基：不含凝固劑（如瓊脂），呈液體狀態(tài)。用途：擴大培養(yǎng)獲得大量菌種、常用于工業(yè)生產。（2）固體培養(yǎng)基：含凝固劑（如瓊脂），呈固體狀態(tài)。用途：分離、計數、鑒定等。拓展了解：培養(yǎng)基的分類（按照化學成分分類）（1）天然培養(yǎng)基：含化學成分不明確的天然物質。用途：工業(yè)生產。（2）合成培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分明確。用途：分類、鑒定。培養(yǎng)基的分類（按照用途分類）（1）選擇培養(yǎng)基：允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長。用途：培養(yǎng)、分離出特定微生物。（2）鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品,用以鑒別不同種類的微生物。用途：鑒別不同種類微生物。4.怎樣將液體培養(yǎng)基制成固體培養(yǎng)基？加入適量瓊脂。（P9）5.實驗室中最常用的培養(yǎng)基之一：瓊脂固體培養(yǎng)基。（P9）6.微生物在瓊脂固體培養(yǎng)基的表面或內部生長，可以形成菌落。（P9）7.培養(yǎng)基的基本成分：各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽等營養(yǎng)物質，此外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質以及O2的需求。（P10）8.碳源:（1）概念：提供碳元素的物質。（2）分類:無機碳源，如CO2、CO32-、HCO3-等。有機氮源，如葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。（3）適用范圍（一般情況下）添加無機碳源培養(yǎng)基用來培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；添加有機碳源培養(yǎng)基用來培養(yǎng)異養(yǎng)微生物。9.氮源:（1）概念：提供氮元素的物質。（2）分類:無機氮源，如N2、NO3-、NH3、NH4＋等。有機氮源，如牛肉膏、蛋白胨、尿素等。（3）適用范圍（一般情況下）不添加氮源培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)固氮微生物。10.為什么培養(yǎng)基需要氮源？培養(yǎng)基中的氮元素是微生物合成蛋白質、核酸等物質所必需的。11.含C、H、O、N的有機物可作為異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。12.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物培養(yǎng)基的主要差別在于碳源。13.能否根據培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質判斷微生物的代謝類型？可以，例如自養(yǎng)型微生物所需的碳源來自無機碳源，異養(yǎng)型微生物所需的碳源來自有機碳源。14.無機氮源能給自養(yǎng)型微生物提供能源嗎？可以，例如NH3既作為硝化細菌的氮源，也作為能源（NH3氧化釋放的化學能）。15.無機鹽除了可以調節(jié)酸堿平衡、維持一定的滲透壓之外，還能有什么功能？有些無機鹽離子可以作為化能合成菌的能源（如鐵細菌）有些無機鹽離子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶）16.在提供主要營養(yǎng)物質的基礎上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質以及O2的需求。17.是否所有培養(yǎng)基中都必須添加碳源、氮源？不是，例如分離固氮菌不需要額外添加氮源，其可以直接利用空氣中的氮氣。（二）無菌技術1．獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵：防止雜菌污染。（P10）2.無菌技術應圍繞如何避免雜菌的污染展開。（P10）3.無菌技術主要包括消毒和滅菌。（P10）4.無菌技術工作兩個方面(1)對操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。(2)對用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌。（P10）5.做好消毒滅菌工作后，要注意：實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。（P10）6.為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，應如何操作？在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。（P10）7.無菌技術除用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？無菌技術還能有效避免操作者被微生物感染。8.消毒:(1)概念：是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物。（P10）(2)方法:a.日常生活中經常用到煮沸消毒法，操作方法：100℃煮沸5～6min；b.對于一些不耐高溫的液體如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s-1min；c.生物活體、水源等還可使用化學藥物進行消毒，操作方法：用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等；d.接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射，操作方法：紫外線照射30min。（P11）9.滅菌:（1）概念：是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（P10）（2）方法:a.培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等一般用濕熱滅菌法，其中高壓蒸汽滅菌的效果最好，操作方法：高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa，溫度121℃,15～30min。b.耐高溫的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿、金屬用具等，可以用干熱滅菌法，操作方法：物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h。c.接種過程中，微生物的接種工具、試管口、瓶口通過灼燒滅菌法來滅菌，操作方法：直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒。（P11）10.使用高壓蒸汽滅菌鍋時，能不能直接密封升溫？不能，一定要將鍋內冷空氣徹底排出，才能密封升溫，否則，可能引起鍋內壓力達到設定值而溫度不能達到要求。11.高壓蒸汽滅菌鍋滅菌完畢后，可以立刻放氣減壓嗎？不能，若立即放氣減壓瓶內液體會劇烈沸騰，沖掉瓶塞而外溢，甚至導致容器爆裂（須待滅菌鍋內壓力降至與大氣壓相等后才可打開排氣閥開蓋）。12.酒精消毒的最適范圍是體積分數為70%-75%的酒精。原因：酒精濃度過高時，菌體表面蛋白質變性過快，從而凝固形成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其中，酒精濃度過低時，殺菌能力減弱。13.用紫外線進行消毒時，可以怎么做來加強消毒效果？照射前，適當噴灑酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。14.高壓蒸汽滅菌使用的儀器為高壓蒸汽滅菌鍋，以水蒸氣為介質，滅菌條件為壓力200kPa、溫度121℃、時間15-30min。15.干熱滅菌法使用的儀器為干熱滅菌箱，以熱空氣為介質，滅菌條件為溫度160-170℃、時間2-3h。16.灼燒滅菌是將需滅菌的用具直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，優(yōu)點是可以迅速徹底地滅菌。（三）微生物的純培養(yǎng)1．純培養(yǎng)概念：在微生物學中，將接種于培養(yǎng)基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養(yǎng)物。（P11）2.純培養(yǎng)物概念：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。（P11）3.純培養(yǎng)概念：獲得純培養(yǎng)物的過程。（P11）4.微生物純培養(yǎng)的步驟：微生物的純培養(yǎng)包括配制培養(yǎng)基、滅菌、接種、分離和培養(yǎng)等步驟。（P11）5.微生物純培養(yǎng)的原理：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后得到的單菌落一般是由單個微生物形成的純培養(yǎng)物。（P12）6.菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結構的子細胞群體。（P12）7.一個單菌落即一個種群。8.菌落通常可以用來作為鑒定菌種的重要依據。9.獲得單菌落的方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法。（P12）10.培養(yǎng)基的滅菌方法高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法）；培養(yǎng)皿的滅菌方法干熱滅菌（也可用濕熱滅菌法）。11.倒平板時使培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。（P12）12.培養(yǎng)基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時開始倒平板？瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時，若低于50℃不及時操作，瓊脂會凝固。13.為什么倒平板和接種整個過程要在酒精燈火焰旁進行？避免雜菌污染。14.拔掉瓶塞后為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。15.在倒平板的過程中，若不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？不能。為什么？因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。16.倒平板時，能將培養(yǎng)皿的皿蓋拿下來放在一邊嗎？不能。應如何做？用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙。為什么？防止雜菌污染培養(yǎng)基。17.剛倒完平板，可以直接倒置嗎？不能，應等培養(yǎng)基冷卻凝固。18.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？防止皿蓋上冷凝的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染（避免培養(yǎng)基水分過快蒸發(fā)）。19.怎么確定所倒平板未被雜菌（主要是細菌）污染？將未接種的空白培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底(該操作也可確定培養(yǎng)基滅菌是否徹底）。20.未接種的培養(yǎng)基直接培養(yǎng)起什么作用？做空白對照，判斷培養(yǎng)基是否被污染，判斷培養(yǎng)基滅菌是否徹底；若培養(yǎng)后培養(yǎng)基表面無菌落，則說明培養(yǎng)基沒有污染。21.若未接種的培養(yǎng)基表面出現菌落，說明了什么？說明培養(yǎng)基被污染，實驗組的菌落中可能存在雜菌。22.劃線工具接種環(huán)。23.連續(xù)劃線的目的：將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，經過數次劃線后培養(yǎng)可以分離得到單菌落。24.平板劃線法過程中，接種環(huán)蘸了1次菌液；若分五個區(qū)劃線，則接種環(huán)共需灼燒6次；25.灼燒后的接種環(huán)可以直接劃線嗎？不可以。應如何操作？待接種環(huán)冷卻后再劃線。為什么？避免溫度過高殺死菌種。26.從第二次劃線開始，都應從上一次劃線的末端開始往下一區(qū)域劃線。27.劃線注意事項：（1）不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。（2）每次劃線首尾不能相接。（3）每次劃線前接種環(huán)進行灼燒滅菌。（4）最后一次劃線結束也應該進行灼燒滅菌。28.整個操作中灼燒接種環(huán)的不同目的：取菌種前：殺死接種環(huán)上原有微生物，避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種。每次劃線前：殺死上次劃線結束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時接種環(huán)上的菌種直接來源于上一次劃線的末端。接種結束后：及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者。29.除第一次劃線外，每次劃線都從上一次劃線的末端開始，目的是什么？使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落（課本：將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面，經數次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落）。30.為什么劃線時要注意不能劃破培養(yǎng)基？（1）一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；（2）存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。31.培養(yǎng)酵母菌：完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板（一般做三組，目的：平行重復實驗）和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。31.警示：（1）在實驗室中，切不可飲食，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染；（2）使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數（一）選擇培養(yǎng)基1.尋找耐高溫DNA聚合酶的思路是什么？根據微生物對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。2．水生棲熱菌的篩選：水生棲熱菌能在70～80℃的高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。（P16）3.從環(huán)境中獲得某種特定種類的微生物的原理：某些微生物適應某些特定的環(huán)境條件，而絕大多數微生物在這種條件下不能生存，就可以從特定的環(huán)境中篩選得到特定種類的微生物。（1）在被石油污染的土壤中可以篩選石油分解微生物。（2）在冰川凍土層可以篩選耐寒微生物。（3）漆酶屬于木質降解酶類，分離產漆酶菌株的首選樣品是生活污水嗎？不是。4.實驗室篩選微生物原理：人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度和pH等），同時抑制或阻止其他微生物的生長。5．選擇培養(yǎng)基：在微生物學中，允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。（P16）6.選擇培養(yǎng)基三種篩選方法：（1）利用營養(yǎng)缺陷進行選擇培養(yǎng)。*營養(yǎng)缺陷的微生物不能正常生長（2）利用添加某種化學物質進行選擇培養(yǎng)。*添加殺傷性物質，有抗性的可以生長，無抗性的死亡（3）利用改變培養(yǎng)條件進行選擇培養(yǎng)。*調節(jié)溫度、pH等生長條件，只有適應的可以生長7.選擇培養(yǎng)基實例（1）目的：分離酵母菌、霉菌等真菌，防止細菌生長。原理：青霉素能抑制細菌生長，對真菌無作用。配制：使用加入青霉素的培養(yǎng)基。（2）目的：分離固氮菌。原理：固氮微生物能利用空氣中的氮氣。配制：使用不加氮源（以N2為氮源）的培養(yǎng)基。（3）目的：分離自養(yǎng)型微生物。原理：自養(yǎng)型微生物能利用無機碳源。配制：使用不加有機碳源（以CO2為碳源）的培養(yǎng)基。（4）目的：分離耐酸菌。原理：耐酸菌能在pH為酸性的條件下生長。配制：使用將pH調至酸性的培養(yǎng)基。8.選擇培養(yǎng)基的制備原理：根據不同微生物的特殊營養(yǎng)要求或對其某一化學、物理因素的抗性不同而制備選擇培養(yǎng)基。9.如何設計培養(yǎng)基篩選分解尿素的細菌？以尿素作為唯一氮源設計選擇培養(yǎng)基，只有能合成脲酶的細菌才能生長發(fā)育繁殖。10.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同。11.在選擇培養(yǎng)基上生長的一定是所選擇的目的菌嗎？不一定，有些微生物可以利用目的菌的代謝產物來生長繁殖，所以還需要進一步驗證。12.怎么證明一個選擇培養(yǎng)基具有選擇性？應該設置基礎培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）或完全培養(yǎng)基作為對照，若基礎培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中生長的菌落數菌多于該選擇培養(yǎng)基，則該選擇培養(yǎng)基具有選擇性。（二）微生物的選擇培養(yǎng)1.微生物的選擇培養(yǎng)方法：稀釋涂布平板法。（P17）2.稀釋涂布平板法基礎操作：梯度稀釋和涂布平板。3.稀釋涂布平板法方法概述：由于土壤細菌的數量龐大，要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物，必須要對土壤進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上。（P17）4.平板劃線法的作用：分離純化微生物。稀釋涂布平板法的作用：分離純化微生物、統計樣品中活菌的數目。5.分離純化微生物具體含義：將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)得到單菌落（即純培養(yǎng)物）。（P18）6.③號試管稀釋倍數為104。7．分解尿素的細菌的分離：分解尿素的細菌能合成脲酶，該酶能催化尿素分解產生NH3，以此作為細菌生長的氮源。要將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養(yǎng)基的配方設計思路是培養(yǎng)基中除含有細菌必需的碳源、水、無機鹽外，只含有尿素一種氮源。8．稀釋涂布平板法分離分解尿素的細菌操作過程如下：采集土樣→將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋→取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面（多了不易被吸收）→將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中→將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布→用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使涂布均勻→涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃的恒溫箱中培養(yǎng)1～2d，在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。（P17）（三）微生物的數量測定1.微生物的數量測定方法：間接計數法——稀釋涂布平板法、直接計數法——顯微鏡直接計數法。（P18）2．稀釋涂布平板法原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。（P18）3.樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數目。（P18）4.稀釋涂布平板法的計數原則：（1）選擇菌落數為30-300的平板計數；（2）同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。（P18）5.稀釋涂布平板法結果分析：（1）統計的菌落數往往比活菌的實際數目少；這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。（2）統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。（P18）6.C代表某一稀釋度下平板上生長菌落數的平均值；V代表涂布平板時吸取的稀釋液體積數值(mL)；M代表稀釋倍數；則每g樣品中的細菌數=（C÷V）×M。7.將1ml水樣稀釋100倍，在三個平板上用涂布法分別接入0.1ml稀釋液；經適當培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數分別為39、38和37。據此可得出每升水樣中的活菌數為(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。8.恰當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。9．顯微鏡直接計數法原理：利用特定的細菌計數板或血細胞計數板在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。10.顯微直接計數法使用的計數工具：血細胞計數板常用對相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等計數；細菌計數板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。11.顯微直接計數法優(yōu)點：快速直觀。12.顯微直接計數法缺點：（1）統計結果一般是活菌數和死菌數的總和。原因：不能區(qū)分死菌與活菌。（2）個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。（P18）土壤中分解尿素的細菌的分離與計數1.實驗原理：絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。（P18）2.實驗步驟：土壤取樣→制備培養(yǎng)基→樣品的稀釋與涂布平板→微生物的培養(yǎng)與觀察。（P19）3.土壤取樣：（1）取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。（P19）原因：細菌適宜在該環(huán)境中生長。（2）取樣過程：取樣時一般要鏟去表層土。原因：細菌絕大部分分布在距地表3-8cm的土壤層。（3）注意事項：取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。4.制備培養(yǎng)基:（1）作對照：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。（P19）作用：作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。（2）實驗組：選擇培養(yǎng)基。特點：以尿素為唯一氮源。KH2PO4和Na2HPO4的作用：提供無機鹽、調節(jié)pH。尿素作用：氮源。葡萄糖作用：碳源。5.樣品的稀釋與涂布平板:（P19）（1）每個濃度至少設置4個平板。1.2.3平板是實驗組，為選擇培養(yǎng)基，做3組的目的平行重復。4是對照組，為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。（2）整個實驗還需要設置2個平板，是哪兩個？不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。目的：用來判斷培養(yǎng)基中是否含有雜菌（培養(yǎng)基滅菌是否合格）。（3）為獲得菌落數在30-300之間適于計數的平板，測細菌時，一般選用104、105、106倍稀釋的稀釋液進行平板培養(yǎng)。（4）在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣才能保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？選用稀