ICSFORMTEXT07.080FORMTEXTCCSO81FORMTEXT?????T/SDASTCT/FORMTEXTSDASTCFORMTEXT××××—FORMTEXT××××FORMTEXT?????基因測序與合成工藝技術要求FORMTEXTTechnicalrequirementsforgenesequencingandsynthesisprocesses征求意見稿FORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××發布FORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××實施FORMTEXT山東科技咨詢協會發布T/SDASTC××××—××××引??言隨著基因測序與合成技術的不斷發展和廣泛應用，其逐漸豐富和滲透至醫學、健康、環境、農業等各個領域。隨著我國基因測序與合成產業相關支持政策集中出臺、公共衛生防控意識升級、國民衛生支出的持續提升，市場規模有巨大的潛力和發展空間。而目前市面上的測序技術、測序儀器及設備更新迭代，因此制定標準化的基因測序與合成工藝流程并加以推廣應用，各生物企業乃至整個國內行業就能獲得一個絕好的技術規范，有利于推動整個行業產業鏈的健康發展，提升整個行業的技術實力，同時確保基因測序與合成工藝流程的質量，獲得可靠的測序數據，避免信息錯誤和信息丟失等情況的出現。由于基因測序與合成技術并非單一技術，涉及到不同技術領域的結合，包括生物、化學、材料、機械、數據處理等，因此本標準僅對常規使用一代測序、二代測序、基因合成的術語、技術指標以及涉及到的技術設備、檢驗檢測方法及常規流程進行說明和規定。基因測序與合成工藝技術要求范圍本文件規定了基因測序與合成工藝流程的總則、原理、樣本處理Sanger測序工藝流程、二代測序（NGS）工藝流程、基因合成工藝流程。本文件適用于對基因測序與合成工藝流程的指導。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T27025-2019檢測和校準實驗室能力的通用要求GB/T30989-2014高通量基因測序技術規程GB/T37873-2019合成基因質量評價通則GB/T40664-2021用于高通量測序的核酸類樣本質量控制通用要求術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1細胞裂解Celllysis指將細胞的結構破裂以釋放其內部成分的過程。3.2引物Primer在DNA復制過程中，結合于模板鏈上并作為復制延伸的起始位點和/或終止位點的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。[來源：GB/T30989-2014]3.3酶切Enzymecutting用特定的限制性\t"/item/%E9%85%B6%E5%88%87%E6%8A%80%E6%9C%AF/_blank"內切酶對\t"/item/%E9%85%B6%E5%88%87/_blank"DNA分子或載體分子在特定的位置進行切割，以獲得特定的粘/平末端用于后續的連接反應。3.4橋式PCRBridgepolymerasechainreaction單鏈文庫DNA一端序列與芯片表面固定的寡核苷酸特異性結合，當連接片段的另一端彎曲，與芯片表面固定的另一條互補寡核苷酸“形成橋”，以文庫DNA為模板進行擴增的反應。3.5二代測序Next-generationsequencing區別于傳統Sanger測序，能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術，通常一次測序反應能產出不低于100Mb的測序數據。3.6接頭Adapter用于標記和固定待測序片段的一小段已知序列的DNA片段。3.7基因測序Genesequencing對核酸分子的核苷酸排列順序的測定，即測定組成核酸分子的腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）或者是尿嘧啶（U）的排列順序。[來源：GB/T30989-2014]3.8基因Gene位于染色體上編碼一個特定功能產物（如蛋白質或RNA分子）的一段核苷酸序列，是遺傳信息的基本單位。[來源：GB/T30989-2014]3.9合成基因Synthesizedgene用生物化學的方法，按照設定的核苷酸序列人工合成的雙鏈DNA。[來源：GB/T37873-2019]3.10文庫Library通過生物來源的、人工合成的或克隆技術所得到的一個重建分子群。例如基因組文庫、互補DNA文庫、噬菌體展示肽文庫等。[來源：GB/T43636]3.11寡核苷酸Oligonucleotide一類短鏈核苷酸的總稱，常用作探針確定DNA或RNA的序列。[來源：GB/T30989-2014]縮略語下列縮略詞適用于本文件。ddNTP雙脫氧核苷核苷三磷酸（DoubleDeoxy-ribonucleosideTriphosphate）

DNA脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）dNTP脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosideTriphosphate）HPLC高效液相色譜儀（HighPerformanceLiquidChromatography）NGS二代測序（NextGenerationSequencing）OPC寡核苷酸純化柱（OligonucleotidePurificationCartridge）PCR聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）RNA核糖核酸（RibonucleicAcid）總則5.1Sanger測序首先利用測序樣品通過測序PCR反應獲得待測序產物，然后對待測序產物進行純化與變性后，將變性產物上樣至基因測序儀中電泳，獲得電泳圖譜，經基因測序儀配套的數據分析系統對圖譜進行分析后，獲得所測序列信息，并形成堿基序列輸出。5.2二代測序5.2.1形成測序文庫：將生物樣本處理形成待測樣品，對待測序的核酸片段兩端連上接頭，通過測序擴增反應，形成測序核酸樣品的測序文庫。5.2.2進行測序反應，同步收集測序信號：加入底物核苷酸，在測序酶的作用下使底物核苷酸與測序文庫中的待測樣品進行結合，同時收集該過程中產生的信號，包括但不限于熒光信號、電信號或離子信號。5.2.3測序信號分析：對得到的測序信號進行處理分析，將信號圖轉變為核苷酸堿基序列信息。5.3基因合成合成基因的DNA序列，在符合國際基因合成聯盟（IGSC）生物安全要求條件下，其質量要求，包括DNA純度、總量、完整性與序列一致性。合成的基因應符合GB/T37873-2019的質量評價要求。5.4實驗人員操作要求實驗室的人員應按照GB/T27025-2019的要求，實驗操作人員應具備良好的分子生物學專業技術操作規范。5.5儀器設備要求各實驗區域應有專用的儀器設備，同一區域內的儀器設備、物品和工作服應有明顯標記，避免與其他區域的物品混用。儀器設備的校準應符合GB/T27025-2019的規定，主要儀器設備參見附錄A。5.6其他要求所有實驗使用的試劑等級應為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑。試劑的選購、驗收、貯存應符合GB/T27025-2019規定。實驗用水應符合GB/T6682-2008中一級水的規格。去離子水的電阻應達到18.2mΩ。商品試劑盒應注明到貨日期，對所收到的試劑盒應按規定的貯存條件存放，主要試劑及溶液參見附錄B。原理堿基互補配對原理在DNA分子結構中，堿基之間的氫鍵具有固定的數目，且DNA兩條鏈之間的距離保持不變。DNA分子結構的4種堿基之間的配對遵循一定的規律，即A僅與T配對，G僅與C配對，反之亦然。腺嘌呤與胸腺嘧啶之間有兩個氫鍵，鳥嘌呤與胞嘧啶之間有三個氫鍵，即A=T、G≡C。根據堿基互補配對的原則，一條鏈上的A的數量等于互補鏈上的T的數量；一條鏈上的G的數量等于互補鏈上的C的數量，反之亦然。亞磷酰胺三酯法原理亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。具體流程見附錄C.1。Sanger法測序原理每一輪序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有的四種dNTP，并混入少量一種ddNTP。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3′-OH基團，在DNA合成反應中不能形成磷酸二酯鍵，用來中端DNA合成反應，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例的帶有熒光同位素標記的某種ddNTP，通過凝膠電泳和放射自顯影，就可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。具體流程見附錄C.2。一代測序儀在強電場的作用下，熒光標記的DNA片段通過毛細管中的高分子聚合物從負極向正極移動；片段越短，移動速度越快，長度不同的DNA片段依次通過檢測窗口；熒光分子在檢測窗口被激光激發產生熒光信號，熒光信號被CCD相機掃描，傳遞給計算機測序數據實時收集軟件并轉換成原始數據信號，分析軟件分析原始數據信號呈現出最終的測序峰圖。邊合成邊測序原理將生物樣本制備成待測樣品，通過橋式PCR擴增技術，將待測樣品量放大，并收集成文庫，然后進行平行循環測序。利用邊合成邊測序的策略，加入一種或多種帶標記的底物核苷酸，在聚合酶的作用下，按照堿基互補配對原則，進行DNA鏈的延伸，延伸一輪測取一輪底物與模板結合后發出的熒光信號，收集該信號并確定所測位點的堿基信息；當上輪測序完成后，利用可逆技術，繼續進行下一輪反應，重復測序過程，即可實現高通量基因測序。樣本處理7.1樣本提取7.1.1樣本前處理根據不同生物樣本選擇的不同處理方式，動植物組織使用液氮研磨；哺乳動物血液樣本使用紅細胞裂解液對紅細胞去除；細胞樣本/貼壁細胞經胰酶消化處理再做收集；細菌樣本溶菌酶破壁處理；真菌樣本經酶解破壁或液氮凍融或超聲裂解；FFPE樣本使用二甲苯或礦物油類的物質進行脫蠟處理方式。7.1.2樣本裂解根據生物樣本的不同，參照附錄D.1和附錄D.2方法進行裂解。7.1.3核酸分離純化根據實驗室具體情況，選擇附錄D.3和附錄D.4方法進行DNA和RNA的分離純化。7.2樣本質量檢測評估對常規樣本的核酸提取純化方法的一般性評價，具體見GB∕T37874-2019和GB∕T40664-2021。Sanger測序工藝流程核酸提取及質量評估具體見第7章樣本處理。引物設計使用引物設計軟件根據待測基因序列設計所需的引物。引物長度一般在17bp~25bp；G+C含量在40%~60%之間，45%~55%最佳；引物所對應的模板序列的Tm值在55℃~80℃之間，最好為72℃左右；引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾，且3'端的堿基一般不用A；堿基隨機分布，盡量均勻，不能有連續4個堿基的互補。測序PCR模板擴增在模板中加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP，通過PCR儀的溫度變化控制DNA的變性和復性，完成特定基因的體外擴增，得到充足的模板。PCR產物純化去除PCR反應液殘留的引物、dNTPs、鹽成分、非特異PCR產物等，以防止后期測序PCR反應中出現多重測序，抑制測序酶活性，擴增出同源性區域。測序PCR反應使用Sanger測序試劑盒，加入PCR產物及引物進行測序PCR反應。測序反應產物純化對測序PCR產物進行純化，過濾混合物，去除ddNTP等其他雜質，只留下長短不一的目的PCR片段。上機測序制備凝膠后，對一代測序儀儀器通道排除氣泡后，開始測序，通過激光照射，讀取熒光基團，得到一代測序結果。二代測序工藝流程樣本制備和質量評估樣本制備和質量評估按照第7章樣本處理要求執行。9.2構建文庫文庫制備對于成功進行二代測序工作流程至關重要。該步驟會制備出兼容測序儀的DNA樣本。本流程包括常用的DNA建庫和mRNA建庫流程，具體建庫流程圖參見附錄C.3、C.4、C.5。9.2.1DNA文庫構建一般規定根據待測目的基因性質，特定基因需設計所需的引物（見8.2），再經過目的片段DNA的擴增（見8.3），獲得足夠濃度和純度的目標DNA片段；非特定基因按9.1的要求獲得足夠濃度和純度的DNA。DNA文庫使用建庫試劑盒構建。片段化將目標DNA片段使用限制性內切酶或超聲波打斷進行片段化處理。末端修復將隨機打斷、末端不平的片段化DNA通過末端修復酶進行末端補齊和5’端磷酸修飾。添加接頭經過末端修飾后的DNA片段3'末端具有突出的A尾，而接頭具有突出的T尾，使用連接酶將接頭添加到DNA片段兩端，形成“Y”形接頭。PCR擴增純化添加了接頭的DNA片段，可通過與接頭互補的引物來擴增，富集文庫，再通過磁珠法對文庫純化，以去除雜質和未連接的接頭或接頭二聚體。9.2.2常規mRNA文庫構建不論真核生物還是原核生物，其RNA中最多的是rRNA，其占比高達80%。如果直接對樣本的總RNA進行測序，測序數據中絕大部分將為rRNA的相關數據，因此通過RNA富集的方法去除rRNA，得到純化的mRNA。然后再進行文庫構建。mRNA純化.1poly(A)純化：真核生物的mRNA的3'端具有poly(A)尾結構，用帶有Poly(T)探針的磁珠與總RNA進行雜交。然后Poly(T)探針就和帶Poly(A)尾巴的mRNA結合在一起，通過回收磁珠，去除其他RNA，見附錄C.4。.2去除rRNA：通過使用與rRNA互補的寡核苷酸探針與總RNA樣品雜交去除16S和23SrRNA，見附錄C.5。片段化處理將含有金屬離子（Mg2+、Zn2+）的打斷buffer，對RNA進行打斷。根據需要的文庫片段大小選擇合適的打斷溫度和時間。合成cDNA被打斷的這些mRNA片段，通過隨機六聚體引物，逆轉錄酶以mRNA為模版合成cDNA。合成雙鏈DNA加入dNTP、聚合酶以cDNA為模板在PCR儀中進行雙鏈DNA合成，并加入RNaseH、磷酸化酶、外切酶將雙鏈DNA末端補齊以及對雙鏈DNA的5’端進行磷酸修飾和3’末端突出的A尾修飾。添加接頭通過T4DNA連接酶和含有高濃度鹽離子及PEG的連接buffer，在雙鏈的cDNA的兩端接上“Y”型的接頭（每個接頭都有一個index，不同的文庫構建可以使用不同的index）。片段選擇利用磁珠對產物進行純化與分選，去除雜質及接頭二聚體，獲得所需大小的目的片段。PCR擴增、純化針對核酸樣本建庫的不同起始量，選擇合適的擴增循環數進行擴增來富集文庫。9.3文庫質檢對建好的文庫進行文庫濃度的定量和文庫質量評價，良好的文庫應有足夠的濃度并在預計大小的位置有一個較窄的峰，而其他位置無峰。9.4上機測序根據數據量及文庫片段長度，采用多重分析法，將多個文庫混合并在定量后進行變性處理。單鏈化的文庫DNA片段通過二代測序儀進行邊合成邊測序得到測序數據。測序儀中的具體流程見附錄E。基因合成工藝流程本標準所述基因合成的內容主要包含引物合成（短片段）和基因合成（長片段）的合成。具體流程圖見附錄C.6和附錄C.7。引物合成10.1.1單體溶解取有效期內的A、T、C、G四種單體試劑，加入乙腈溶解固體粉末，待單體全部溶解，除氣泡后備用。10.1.2寡核苷酸（Oligo）片段合成根據目的寡核苷酸片段序列，在合成儀上合成特定的寡核苷酸（Oligo）片段，一般引物長度在20個堿基左右，最長一般不超過60個堿基，具體流程見附錄F。10.1.3切割和脫保護基切割將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常用新鮮的濃氨水來裂解CPG上連接化合物與初始核苷間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3'羥基，可以參與生化反應。脫保護基胸腺嘧啶不需要保護基團，但腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤需要，因為它們含有環外伯氨基。必須除去保護基團，以便可以形成寡核苷酸與靶核酸之間的適當氫鍵。須在此步前選好后續的純化方法。用新鮮的濃氨水處理較長時間以脫掉腈乙基、苯甲酰基、異丙基，用三氟乙酸脫5'-DMT。10.1.4純化/分裝通過DSL、OPC、PAGE、HPLC等方式純化引物，測定OD260定量，根據要求干燥/分裝。通常寡核甘酸的穩定性很好，-20℃可穩定保存一年以上。針對不同的需求，可選擇不同的純化方式，不同純化方式的選擇依據見附錄G。基因合成10.2.1序列分析和優化分析訂單方案與基因序列，以及方案目標與序列結構、GC含量特征，制定合適的構建方案并設計引物。10.2.2引物合成根據設計好的引物序列，使用Oligo化學合成的方式，合成帶有重疊區域的40~200nt的小片段引物，并進行后續的氨解、純化，并對引物質量進行檢測（見10.1）。10.2.3寡核苷酸拼接使用重疊PCR的技術，將單鏈的引物拼裝成雙鏈的基因片段，對于3Kb以內的且無復雜二級結構的基因，可直接進入全長組裝；如果基因全長超過3Kb，則需要進行分片段組裝。10.2.4連接轉化將獲取的目的基因連接到克隆載體（載體pUC57）或客戶指定的目的載體上，轉化到感受態細胞中，將細胞與連接產物和LB培養基混合，并在37℃搖床上以200rpm恢復，均勻涂布在具有相應抗性或其他篩選平板上，37°C下過夜培養菌落。10.2.5陽性克隆篩選與測序將挑取的陽性克隆單菌落擴大培養并進行一代測序，測序結果與目標序列完全匹配，即表明基因序列符合要求。10.2.6酶切質檢將測序正確的質粒提交質檢部門，用于酶切實驗驗證，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測為雙條帶，并且條帶大小與載體、目的片段大小一致，即表明質粒形態、大小符合要求。10.2.7成品將測序正確、酶切質檢正確的高純度凍干質粒，含有重組質粒的穿刺菌或甘油菌以及報告（含測序結果、COA報告、SQD文件、SEQ文件等）。

附錄A（資料性）主要儀器設備A.1離心機實驗室通用離心機，應符合YY/T0657-2008的要求。A.2低溫離心機應符合YY/T0657-2008的要求。A.3PCR儀應符合YY/T1173-2010的要求。A.4紫外分光光度計應符合JB/T6777的要求。A.5電泳裝置應符合YY/T0087-2004的要求。A.6通風櫥應符合YY0569的要求。A.7引物合成儀A.8引物純化儀A.9電泳凝膠成像系統A.10一代測序儀A.11可調移液器應符合JJG646的要求。A.12二代測序儀行業內不同的二代測序儀采用不同的大規模擴增方法，較為常見的有EPCR擴增、橋式PCR擴增，可根據具體的擴增方法選擇符合國家或行業內現行有效標準的大規模擴增儀器設備。二代測序技術中，基因測序儀應至少達到下表的要求：序號基本參數說明1測序通量≥100Mbp2堿基識別質量>203測序準確率Q值過濾之后的準確率≥99.9%4Fluidcell升降溫速度室溫25℃條件下，Fluidcell溫度從25℃升到65℃的時間≤50s室溫25℃條件下，Fluidcell溫度從65℃升到25℃的時間≤250s注1：Q值過濾，即去除低質量的測序結果，保留較為可信的測序結果。附錄B（資料性）主要試劑及溶液B.1CTAB裂解液Tris-HCl(PH8.0)提供一個緩沖環境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環境，使DNA充分溶解于液相中。B.2Trizol溶液異硫氰酸/硫氰酸胍(GITC)：屬于解偶劑，將RNA釋放到溶液中。酚和8-羥基喹啉；β-巰基乙醇：主要破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。B.3DNA提取試劑盒用于從生物樣本中提取待測樣本，進行Sanger測序或者二代測序，試劑盒內至少應包含：細胞裂解液、洗脫液、TEbuffer。B.4Sanger測序試劑盒用于對待測序樣本進行上機前的擴增，得到差一個堿基的多條擴增產物。試劑盒應至少包含：測序酶、dNTPs、熒光標記的ddNTPs、Buffer。B.5建庫試劑盒用于核酸樣品的基因文庫構建，試劑盒內至少應包含：接頭、T4DNA連接酶、DNA聚合酶、緩沖液。B.6二代測序試劑盒用于對測序文庫進行高通量基因測序，試劑盒應至少包含測序引物、測序酶、緩沖液。B.7基因合成涉及試劑三氯乙酸C2HCl3O2Trichloroaceticacid（TCA）亞磷酰胺C52H62N3O7P四氮唑CH2N4Tetrazole乙酸酐C4H6O3Aceticanhydride碘I2Iodine氨水NH3·H2Oaqueousammonia含氨25%～28%的水溶液乙腈C2H3NAcetonitrile

附錄C（資料性）工藝流程示意圖C.1亞磷酰胺三酯合成法示意圖C.2Sanger測序工藝流程C.3傳統DNA建庫工藝流程C.4基于oligo-dT富集的mRNA建庫流程C.5基于酶法的rRNA去除的mRNA建庫流程C.6引物合成工藝流程示意圖C.7基因合成工藝流程示意圖附錄D（資料性）主要實驗方法D.1基因組DNA裂解D.1.1CTAB法CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子去污劑，可以溶解細胞膜，與核酸結合形成在高鹽環境下可溶的復合物。D.1.2SDS法SDS法（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去垢劑，高溫（55-60℃）裂解細胞，蛋白變性，染色體離析，在高鹽環境下或降低溫度后蛋白、多糖等結合形成的復合物沉淀，釋放核酸。D.2質粒DNA裂解D.2.1堿裂解-SDS法在氫氧化鈉（PH12-12.6堿性環境）和去污劑SDS的作用下細胞破裂，細菌蛋白質和染色體DNA變性，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA變性。加入酸性高鹽緩沖液后PH恢復中性，共價閉合環狀質粒DNA復性速度快于線性的染色體DNA。細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物被SDS包蓋。之后復合物沉淀下來，質粒DNA留在上清中。D.2.2煮沸法含有TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中加熱至100℃使細菌裂解。通過加熱破壞細菌外壁的同時有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。溫度下降后，閉環DNA形成超螺旋分子，離心時留在上清中。D.3DNA分離純化D.3.1酚氯仿抽提法該方法包括兩個步驟：1）利用酚氯仿對裂解體系進行反復抽提，使蛋白質變性，以去除蛋白質，實現DNA與蛋白質的分離；2）再用醇將DNA沉淀下來，實現核酸與鹽的分離。D.3.2離心柱法獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，然后基因組DNA在高鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。D.3.3磁珠法將純化介質包被在納米級的磁珠表面，通過介質對DNA的吸附，在外加磁場的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動，從而達到核酸與其它物質分離的目的。D.4RNA提取Trizol溶液使蛋白質和RNase變性并分離，釋放RNA至溶液中。加入氯仿后進行離心，樣品分層為無色的水樣層和黃色的有機層，在酸性條件下總RNA保留在上層水相中。大部分DNA和蛋白質保留在中間相或下層有機相。收集上述水樣層，通過異丙醇沉淀回收RNA。

附錄E（資料性）二代測序儀測序步驟E.1吸附和互補鏈合成制備好的單鏈DNA文庫P5序列與Flowcell的P5'互補，吸附在芯片上。以寡核苷酸為引物、文庫片段為模板，在DNA聚合酶的作用下，從雜交點的3'端到5'端延伸合成互補鏈，形成雙鏈DNA。解鏈后原始文庫中的DNA鏈，留下新合成的單鏈DNA。E.2“橋”式擴增單鏈DNA另一端的接頭序列與相鄰的另一種寡核苷酸互補結合，進行“橋”式擴增，形成DNA簇，通過特定的酶切除與flowcell上P7序列不結合的DNA鏈（即反鏈），只保留與P7結合的DNA鏈。E.3Reads讀取流通池中加入測序引物、DNA聚合酶、不同顏色的可逆終止熒光基團dNTP。一個循環延長一個堿基，洗脫游離的dNTP，激光掃描判斷堿基種類。一個循環結束后加入化學試劑將疊氮基團和標記的熒光基團切掉，再加入新的dNTP和聚合酶進入下一個堿基的測序反應。E.4Index讀取Read讀取完成，洗去前面的產物，加入index的測序引物，讀取每個樣本特定的index(又稱barcode)，用于標記樣本來源。

附錄F（資料性）寡核苷酸（oligo）片段合成步驟F.1脫保護將預先連接在固相載體可控孔度玻璃（CPG）上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸（TCA）反應，脫去其5'-羥基的保護基團二甲氧基三苯甲基（DMT），獲得游離的5'-羥基；F.2耦連合成DNA的原料—亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，其3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，亞磷酰胺四唑活性中間體與CPG上核苷酸的游離5'-羥基發生親和反應，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈延長一個堿基。F.3蓋帽縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應（少于2%)，如果沒有被封閉，這些羥基基團將在下一個循環中反應，從而導致缺失堿基。因此用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。F.4氧化由于亞磷酸三酯不穩定，在水和吡啶存在下用碘實現亞磷酸三酯的氧化，生成磷酸三酯。F.5循環經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以TCA脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。

附錄G（資料性）引物純化方式針對不同的需求，選擇不同的純化方式。如下表所示：表G.1引物不同用途不同純化方式選擇應用方向純化方式及純度DSLOPCPAGEHPLC純化效率>75%>95%>95%>99%普通PCR/RT-PCR√√√√熒光定量PCR√√√全基因合成√√√一代測序（sanger)√√√√點突變及載體構建√√分子診斷PCR類√√飛行質譜引物√NGS接頭√√NGS捕獲探針√√√擴增子及引物池√√√√G.1DSL純化DSL純化，又稱為脫鹽純化或簡易反相柱純化，是通過高純