NGS和感染性疾病的精準治療

2021/3/29星期一12021/3/29星期一22003年完成了人類基因組計劃2021/3/29星期一3該計劃的完成使得人們強烈的意識到人們需要更多更好的技術與數據分析能力來回答隨之而來的一系列生物學問題。然而，通量的限制以及居高不下的測序成本成為了人們進一步了解基因組的一道坎。2021/3/29星期一4下一代測序（next-generationsequencing，NGS）2000年之后推出的高通量測序平臺很好地解決了這個問題，人類基因組測序的成本直接因此下降50000倍產生了一個新的名詞：NGS2021/3/29星期一5一、NGS是什么？（一）傳統的測序方式大規模平行簽名測序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克隆（PolonySequencing）、454焦磷酸測序（454pyrosequencing）、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、離子半導體測序（Ionsemiconductorsequencing）、DNA納米球測序（DNAnanoballsequencing）等2021/3/29星期一6（二）NGS(nextgenerationsequencing)

包括二代的大規模平行測序和三代的單分子測序。高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定被稱為下一代測序技術(nextgenerationsequencing)足見其劃時代的改變2021/3/29星期一7同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序2021/3/29星期一8（三）測序平臺1、Illumina公司的Solexa測序平臺2、Roche公司的454測序平臺3、ABI公司的寡核苷酸連接檢測平臺(SOLiD)2021/3/29星期一9（四）NGS特點1、不同平臺測序方法不同，但原理有著共通之處，都是將基因組DNA隨機切割成小片段DNA，再通過構建文庫、PCR擴增等技術流程獲得測序模板進行測序及數據分析，相對于Sanger測序來說通量高、速度快、費用低2021/3/29星期一10（四）NGS特點1、高準確性，高通量，高靈敏度2、可以同時完成傳統基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學（基因表達及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究2021/3/29星期一11（四）NGS特點2、越來越多地應用第二代測序技術來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行從頭測序，獲得該物種的參考序列，為后續研究和分子育種奠定基礎；對有參考序列的物種，進行全基因組重測序，在全基因組水平上掃描并檢測突變位點，發現個體差異的分子基礎。2021/3/29星期一122021/3/29星期一132021/3/29星期一14中科院動物研究所已經測序、組裝和分析了38只野生金絲猴的基因組突變。這項研究結果發表在國際分子生物學和進化領域的權威期刊《MolecularBiologyandEvolution》2021/3/29星期一15二、NGS可以為感染性疾病做什么？2021/3/29星期一16（一）宏基因組學（Metagenomics）又叫微生物環境基因組學、元基因組學。它通過直接從環境樣品中提取全部微生物的DNA,構建宏基因組文庫，研究環境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。2021/3/29星期一172021/3/29星期一18對特定環境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進行克隆，并通過構建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質，通過系統學分析獲得該環境中微生物的遺傳多樣性和分子生態學信息2021/3/29星期一19宏基因組學研究的對象是特定環境中的總DNA，不是某特定的微生物或其細胞中的總DNA，不需要對微生物進行分離培養和純化，這對我們認識和利用95%以上的未培養微生物提供了一條新的途徑。2021/3/29星期一20不僅能夠從整體上認識微生物群落自身數量和組成結構，而且可以認識微生物群落自身及其與宿主之間的進化關系，研究不同狀態對微生物群落結構和功能的影響，分析人類正常菌群和疾病狀態下的結構和功能特征。2021/3/29星期一21腸道微生物宏基因組學與人體代謝、免疫等各方面聯系緊密，已成為近年來熱門的研究主題，腸道菌群和糖尿病、肥胖癥等代謝性疾病的關系被不斷深入研究，對于藥物和腸道微生物群落的相互影響也在不斷探索2021/3/29星期一222021/3/29星期一23（二）精準醫學2021/3/29星期一241、第二屆感染性疾病精準醫學高峰論壇感染性（傳染性）疾病危害嚴重，精準診斷是實現其精準防控的前提。目前針對性使用抗生素是一個重大課題，另外即時快速病原診斷、未知病原鑒定、混合感染病原診斷、全病程病原監測等問題都值得重視和研究。2021/3/29星期一25針對感染這一重大醫學問題，需要將基因檢測與傳統檢測相結合，加快將最新的生物科技轉化成先進生產力，應用于臨床感染精準診療。基于下一代測序技術（NGS）的宏基因組學檢測技術發展迅猛，將有力推動感染性疾病精準醫學發展。2021/3/29星期一26NGS在感染性疾病中的應用2021/3/29星期一27NGS技術應用于細菌感染檢測，明確是否存在細菌感染對菌株進行分型，獲得分子血清型、耐藥基因譜等信息，分析其菌株進化歷史、感染源及感染路徑，有助于疾病預防、診療和疫苗研發等。2021/3/29星期一28結核桿菌耐藥菌株培養難度高，時間長，臨床檢測受到極大限制。但基因測序技術在檢測其菌株毒力和耐藥性上有著極大的優勢，可以快速檢測病原體感染及其耐藥性有望取代現有的培養和分子診斷法2021/3/29星期一29病毒NGS技術主要應用于基因型分析、耐藥突變檢測及病毒在宿主體內演化，以及暴發感染病毒的快速檢測時以協助預防、診斷治療及疫苗研究等方面。2021/3/29星期一30真菌通過建立本地真菌基因組學數據并對比分析，不僅可以進行真菌感染快速準確診斷，還能夠發現不同真菌特有的功能性基因，研究其致病機制及藥物耐藥位點突變，發現新的藥物作用靶位點，從而開發具有廣譜、不良反應低、無交叉耐藥性的抗真菌藥物。2021/3/29星期一312011年5月以德國為中心，歐洲暴發了一次嚴重的出血性腸道感染，科學家對病菌菌株進行全基因組測序，發現致病元兇為致死性的大腸埃希菌O104：H4，通過對序列的分析推斷其感染人體的途徑和致病機制，溯源追蹤了其感染路徑，為疫病的診斷和治療提供了重要信息。2021/3/29星期一32同年6月法國也發生了類似感染，NGS序列分析發現德國大腸埃希菌菌株基因多樣性遠低于法國菌株，由此確認其為法國暴發病原體的演化支，明確了感染源2021/3/29星期一33北京協和醫院在《InternationalJournalofInfectiousDiseases》發表了國內mNGS用于臨床中樞神經系統(CNS)感染患者布氏桿菌檢出的文章。2016年6月1日至2017年6月1日臨床懷疑CNS感染患者的腦脊液樣本。mNGS快速檢出4例患者布氏桿菌感染，結合臨床癥狀和RT-PCR結果驗證，患者確診為神經型布氏桿菌病。mNGS檢出序列數從11-104不等，覆蓋度從0.0043%-0.4%不等。4例布氏桿菌感染的確診，展現了mNGS在臨床疑難感染病原檢測應用的突出優勢。2021/3/29星期一348月齡患兒“發熱12天，間斷抽搐8天，睡眠增多6天”就診，持續間歇性高熱和抽搐。通過mNGS技術檢出單純皰疹病毒1型(HSV-1)序列數高達35078條，占比99.66%，覆蓋度為95%，在相對比例和病毒基因組覆蓋度方面都達到了明確診斷HSV-1感染的強度。2021/3/29星期一35隨后甘露醇降顱壓后，阿昔洛韋抗病毒及其他對癥治療后患兒痊愈出院。本文表明除不容易發現的病原外，mNGS針對較為常見的皰疹病毒具有明確診斷意義，為臨床不明原因的CNS感染性疾病提供了重要的病原學診斷方法。2021/3/29星期一362014年西非暴發了記錄中最大的一次埃博拉病毒感染，暴發時間長，感染和死亡人數高，在世界范圍內引起了極大恐慌。2021/3/29星期一37通過NGS技術結合數據分析，研究者明確了其基因多樣性和易突變性及流行病學特征，追蹤其感染起始源及感染路徑，預估了病毒感染人體和機體免疫反應的過程，詳細闡述了其在宿主體內通過逐漸適應性突變發生的演化從而減小被免疫細胞識別的機會，對疫情的預防、控制，疾病的診斷、治療和疫苗的研發都起到了極大的促進作用2021/3/29星期一38三、三代測序美國太平洋生物的單分子實時技術及英國牛津納米孔公司的納米孔單分子測序技術特點是不需要進行PCR擴增，通過不同手段區分堿基信號差異，直接讀取序列信息，其讀長長、高通量，可以對RNA和甲基化DNA序列進行直接測序2021/3/29星期一39四、缺點目前還存在錯誤率高、成本較高和生物信息分析軟件不夠豐富等缺點。高通量測序會產生大批量的數據，需要進行龐大的數據分析，如果缺乏本地數據庫，運算工作的成本和時間難以控制；2021/3/29星期一40四、缺點對于疾病，測序得到的