DB××/T××××—××××DB××/T××××—××××ⅠⅠ動物疫病鑒別檢測技術第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒1范圍本文件規定了豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測。本文件適用于豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒的鑒別檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4試驗原理本文件通過特異性引物，在RT-PCR反應體系中擴增出了豬瘟疫苗弱毒126bp及豬瘟強毒335bp的目的產物，當SYBRGreenI熒光染料與擴增產物結合時，熒光信號增強，從擴增產物上釋放出來時，熒光信號急劇減弱，不同DNA擴增產物，Tm值不同，通過Tm值的差異及熒光信號的變化實現了豬瘟疫苗弱毒與豬瘟強毒擴增產物的鑒別。注：SYBRGreenI是一種只與雙鏈DNA小溝結合的染料。5試劑或材料除非另有說明，僅使用分析純試劑。5.1水：GB/T6682，一級。5.2焦碳酸二乙酯（DEPC）水：取1mLDEPC加入水至1000mL，充分震蕩混勻，靜置24h后，121℃高壓滅菌15min，2℃～8℃保存備用。5.3磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mL水中，充分攪拌溶解，滴加濃鹽酸將pH調節至7.4，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌15min，2℃～8℃保存備用。5.4氫氧化鈉溶液（3%）：稱取3g氫氧化鈉，溶于少量水中，放置室溫后，加水定容至100mL。5.5乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（4%）：稱取4g乙二胺四乙酸二鈉，加水定容至100mL。5.6引物：引物名稱和序列見附錄A。5.7商品化病毒核酸提取試劑盒。5.8商品化一步法熒光RT-PCR反應試劑。5.9豬瘟疫苗弱毒陽性對照：市售商品化豬瘟兔化弱毒疫苗（傳代細胞源）。5.10豬瘟疫苗弱毒陰性對照：DEPC水。5.11豬瘟強毒陽性對照：含有豬瘟強毒株擴增目的基因的陽性質粒。5.12豬瘟強毒陰性對照：DEPC水。5.13飲用水：清潔、無異味，pH值在6.5～8.5之間。6儀器設備6.1二級生物安全柜。6.2熒光PCR檢測儀。6.3電子天平：精度0.01g。6.4高速冷凍離心機：轉速≥12000r/min。6.5瞬時離心機：轉速≥6000r/min。6.6低溫冰柜：-70℃以下。6.7高壓蒸汽滅菌器。6.8干熱滅菌器。7樣品7.1采樣工具7.1.1扁桃體采樣器：鼻鉗子、開口器和采樣槍。使用前均用3%的氫氧化鈉溶液浸泡消毒5min～10min，飲用水流水沖洗2min。7.1.2剪子、鑷子經160℃干熱滅菌2h。7.2采樣7.2.1采樣要求采樣過程按照NY/T541執行，采樣及樣品處理過程中應戴一次性手套，樣品間不得交叉污染。7.2.2扁桃體樣品：鼻鉗子固定活豬上顎，用開口器打開口腔，用采樣槍采集扁桃體，滅菌牙簽挑至1.5mL離心管，編號標記。7.2.3內臟樣品：采集病死或安樂死的豬、兔各種內臟器官（脾臟、淋巴結、腎臟、肺臟、盲腸等）裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號標記。7.2.4全血樣品：用無菌注射器采集全血，注入含有1/10體積4%的EDTA溶液的無菌容器內，充分混勻后編號備用。7.2.5排泄物樣品：用棉拭子挑取少許新鮮糞便樣品于離心管內，加入1mLPBS，震蕩混勻，編號標記。7.2.6細胞培養物：取1mL細胞培養物置于離心管內，編號標記。7.2.7疫苗樣品：隨機抽取豬瘟活疫苗樣品3瓶，分別加入2mLPBS，溶解，編號標記。7.3樣品的運輸及保存7.3.1運輸：采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封，在2℃～8℃條件下24h內運送到實驗室。7.3.2保存：采集的樣品在2℃～8℃條件下保存，時間不超過24h；-20℃不超過3個月，-70℃不超過5年。8試驗步驟8.1樣品處理8.1.1扁桃體樣品：樣品加入5倍體積4℃預冷的DEPC水，充分研磨，4℃、10000r/min離心5min，取上清液轉入離心管中編號備用。8.1.2內臟樣品：樣品加入5倍體積4℃預冷的DEPC水，充分研磨，4℃、10000r/min離心5min，取上清液轉入離心管中編號備用。8.1.3排泄物樣品：4℃、10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉入離心管中編號備用。8.1.4細胞培養物：10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉入離心管中編號備用。8.1.5疫苗樣品：10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉入離心管中編號備用。8.1.6全血樣品：全血樣品可直接用做核酸提取。8.2核酸抽提進行豬瘟病毒檢測時，生物安全按照GB19489執行，采用商品化試劑盒提取病毒核酸。8.3熒光RT-PCR檢測8.3.1反應體系的配制反應體系的配制見附錄B。8.3.2加樣在各設定的熒光RT-PCR管中分別加入陽性對照、陰性對照和提取的試樣溶液2μL，蓋緊管蓋，混勻，瞬時離心1min。8.3.3測定參考儀器參數，選擇SYBRGreenI熒光通道。參考擴增條件：第一階段，42℃反轉錄5min；第二階段，95℃預變性10s；第三階段，95℃變性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s，40個循環。72℃時設置采集熒光。第四階段，溶解曲線分析，60℃1min，以0.1℃/s的速率升溫，直到97℃，整個過程連續采集熒光，繪制擴增產物的熔解曲線。9結果判定9.1質控標準9.1.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.1.1.1陰性對照：無Ct值，無典型擴增曲線，在熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃范圍內未出現熔解峰。9.1.1.2陽性對照：Ct值<30.0，并出現典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在81.5℃±0.5℃出現熔解峰，參見附錄C（圖C.1）。9.1.1.3若陰、陽性對照組結果不成立，則視為無效檢驗。9.1.2豬瘟病毒強毒9.1.2.1陰性對照：無Ct值，無典型擴增曲線，在熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃范圍內未出現熔解峰。9.1.2.2陽性對照：Ct值<30.0，并出現典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現熔解峰，參見附錄C（圖C.2）。9.1.2.3若陰、陽性對照組結果不成立，則視為無效檢驗。9.2陰陽性結果的判定9.2.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.2.1.1若檢測樣品無Ct值并且無典型的擴增曲線，在熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃范圍內未出現熔解峰，則判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陰性。9.2.1.2若檢測樣品Ct值≤30.0，出現典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃出現熔解峰，則判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陽性。9.2.1.3若檢測樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃出現熔解峰，則判為可疑。可疑樣本進行雙孔重復試驗，若任一孔或兩孔重復試驗結果為陽性者判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陽性，否則為陰性。9.2.2豬瘟病毒強毒9.2.2.1若檢測樣品無Ct值并且無典型的擴增曲線，在熔解曲線Tm值為83.3℃±0.9℃范圍內未出現熔解峰，則判為豬瘟病毒強毒陰性。9.2.2.2若檢測樣品Ct值≤30.0，出現典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現熔解峰，則判為豬瘟病毒強毒核酸陽性。9.2.2.3若檢測樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現熔解峰，則判為可疑。可疑樣本進行雙孔重復試驗，若任一孔或兩孔重復試驗結果為陽性者判為豬瘟病毒強毒核酸陽性，否則為陰性。

附錄A（規范性）引物A.1引物名稱和序列見表A.1表A.1引物名稱和序列引物名稱引物序列（5′—3′）豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT豬瘟病毒強毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT豬瘟病毒強毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物用DEPC水溶解并稀釋至100μmol/L后，-20℃保存備用；根據需要配制10μmol/L工作液，-20℃保存供檢測使用。′附錄B（規范性）熒光RT-PCR反應體系配制B.1豬瘟病毒疫苗弱毒熒光RT-PCR反應體系配制見表B.1表B.1豬瘟病毒疫苗弱毒熒光RT-PCR反應體系試劑1個檢測反應的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/μL）0.5μL豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物1.0μL豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL試樣溶液2.0uL總體積25.0μLB.2豬瘟病毒強毒熒光RT-PCR反應體系配制見表B.2表B.2豬瘟病毒強毒熒光RT-PCR反應體系試劑1個檢測反應的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/μL）0.5μL豬瘟病毒強毒上游引物1.0μL豬瘟病毒強毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL試樣溶液2.0uL總體積25.0μL附錄C（資料性）豬瘟疫苗弱毒與豬瘟強毒溶解曲線分析