1.2.1微生物的基本培養技術微生物個體無法用肉眼觀察的微小生物。無細胞結構原核細胞真核細胞真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履蟲、變形蟲等微生物的類群病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌體等DNA病毒細菌:藍細菌、大腸桿菌、乳酸菌等；放線菌:鏈霉菌等問題探討

向經過殺菌處理的牛奶中添加某些對人體有益的細菌，再經過發酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復雜，一些人會在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發酵物中呢？

應該先對制作用具和原料進行滅菌處理，再接種純的菌種，并控制發酵條件，避免雜菌進入。這需要應用無菌技術和微生物的培養技術微生物結構簡單、形體微小，眼睛看不到，若想得到純凈的微生物，就必須對其進行培養和分離。實驗室培養微生物的條件①要為人們需要的微生物提供合適的營養和環境條件。培養基②要確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來。無菌技術微生物的純培養1.培養基的概念：3.培養基的類型：2.培養基的作用：人們按照微生物對

的不同需求，配制出供其_________的營養基質。營養物質生長繁殖用以培養、分離、鑒定、保存微生物或

。（①提供微生物繁殖所需各種營養，②異養微生物的能源）積累其代謝物有無瓊脂分離、計數、鑒定等擴大培養、工業生產一、培養基的配置固體培養基液體培養基注意說明①加入培養基中的凝固劑（如瓊脂），一般不能被微生物

利用，只起到凝固作用。②微生物在固體培養基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。③擴大培養獲得大量菌種時，常用液體培養基。一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體4.營養成分：（1）基本成分：碳源、氮源、水、無機鹽①碳源：無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自養微生物異養微生物②氮源：無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等含C、H、O、N的有機物是異養型微生物的碳源、氮源、能源④無機鹽：Ca、K、Mg等為大量元素Zn、Cu、Mn、Fe、Mo等微量元素牛肉膏、蛋白胨來源于動物，含有糖、維生素和有機氮等營養物質③水：良好的溶劑為什么培養基需要氮源？（2）特殊需求：滿足微生物對

、

、

的需求。特殊營養物質pHO2④培養厭氧微生物時，需要提供

的條件。①培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加

；②培養霉菌時，需要將培養基調至

；③培養細菌時，需要將培養基調至

；維生素酸性中性或弱堿性無氧表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養基的營養組成組分含量提供的主要營養牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機鹽H2O定容至1000ml水維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等

主要提供碳源的是牛肉膏，主要提供氮源的是蛋白胨。1、下表為某培養基的配方,下列敘述正確的是()。

從物理性質看該培養基屬于液體培養基該培養基中屬于碳源的物質只有葡萄糖，屬于氮源的物質是蛋白胨該培養基缺少特殊營養物質該培養基調節合適的pH后就可以直接接種使用練習與應用2、下列可以作為硝化細菌氮源的是()。

A.N2、尿素B.牛肉膏、蛋白胨C.尿素、酵母粉D.銨鹽、硝酸鹽碳源、氮源、特殊營養物質碳源調節pH染色劑

獲得純凈的微生物培養物的關鍵是防止雜菌污染！1.獲得純凈的微生物培養物的關鍵是

。防止雜菌污染①消毒：是指使用較為

的物理、化學或生物等方法

殺死物體表面或內部一部分微生物。②滅菌：是指使用強烈的理化方法殺死

的微生物，

包括芽孢和孢子。2.防止雜菌污染的方法：溫和物體內外所有避免已經滅菌的材料用具與周圍物品接觸；為了避免周圍環境微生物污染，操作應在超凈工作臺并在酒精燈火焰旁進行。二、無菌技術芽孢是某些細菌（如芽孢桿菌屬）在營養條件缺乏時，在菌體內形成的一個圓形或橢圓形、含水量低、抗逆性強的休眠體。孢子是脫離親本后能直接或間接發育成新個體的生殖細胞，它是有絲分裂或減數分裂的產物。

超凈工作臺消毒使用較為溫和的物理、化學或生物等方法，殺死物體表面或內部一部分微生物。不包括芽孢和孢子。（1）概念：（2）消毒的方法：①煮沸消毒法：②巴氏消毒法：③化學藥劑消毒法：④紫外線消毒法：用紫外燈照射接種室、接種箱、超凈工作臺。100℃煮沸5-6min。62-65℃下煮30min或80-90℃下煮30s-1min。

用酒精擦拭雙手；氯氣消毒水源。破壞DNA的結構滅菌濕熱滅菌法、干熱滅菌法、灼燒滅菌法1.濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌法）高壓蒸汽滅菌鍋內100kPa、121℃下維持15-30min（1）原理：高溫破壞蛋白質、核酸等結構使其變性。（2）優點：操作簡便，效果可靠，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體。基本保持培養基的營養成分不被破壞。（3）對象：培養基等。注：使用后的培養基必須滅菌后才能丟棄，以免污染環境。滅菌2.干熱滅菌法干熱滅菌箱內160~170℃下加熱2~3h。（1）原理：使微生物細胞膜破壞、蛋白質變性和原生質干燥等（2）對象：耐高溫，需保持干燥的物品，適用于玻璃器皿(如試管、培養皿、吸管、注射器)金屬器具

(如針頭、鑷子、剪刀等)的滅菌滅菌3.灼燒滅菌法常用于涂布器、接種環、接種針、試管口或其它金屬用具等的滅菌。直接在酒精燈火焰的充分燃燒層（外焰）灼燒。（1）效果：最徹底（2）原理：使微生物燃燒（3）對象：接種工具如接種環、接種針，以及接種過程中的試管口或瓶口等易被污染部位類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養基、培養皿等,生產和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa,溫度121℃,15～30min接種室、接種箱，超凈工作臺配制培養基滅菌接種分離培養操作步驟：念珠菌顯色培養基大腸桿菌培養基酵母菌培養基金黃色葡萄球菌和枯草桿菌培養基三、微生物的純培養1.培養物：在微生物學中，將接種于

內，在合適條件下形成的含

的群體。培養基特定種類微生物2.純培養物：由

所獲得的微生物群體。單一個體繁殖3.純培養：獲得純培養物的過程就是純培養。1.菌落：微生物群分散或稀釋單個細胞單個菌落繁殖?酵母菌的純培養3.原理：

分散的微生物(單一個體)在適宜的

表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的

。

固體培養基子細胞群體2.獲得單菌落的方法：①平板劃線法②稀釋涂布平板法形狀、大小、光澤度、顏色、透明度等。方法步驟接種和分離培養酵母菌制備培養基1.制備培養基配制培養基滅菌倒平板1）配制培養基稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖、15-20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL。方法步驟2）滅菌將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15-30min。包器材

將5-8套培養皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內，在160-170℃滅菌2h。高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）干熱滅菌法方法步驟3）倒平板待培養基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板注意事項：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。方法步驟2.接種和分離酵母菌通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。平板劃線法單個細胞微生物群單個菌落連續劃線分散或稀釋生長繁殖①灼燒接種環，直至接種環金屬絲燒紅②在火焰旁冷卻接種環，拔出酵母菌培養液試管的棉塞④在火焰附近用接種環蘸取一環菌液

⑥將皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃3-5條平行線，蓋上皿蓋。⑤試管口通過火焰，并塞上棉塞③試管口通過火焰

⑦灼燒接種環，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。第1區劃線接種環滅菌第2區劃線接種環滅菌第3區劃線接種環滅菌接種環滅菌12345①接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次②劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環進行滅菌④劃線后,培養皿倒置培養平板劃線法注意事項:思考：若完成圖示操作，共做了五次劃線，接種環灼燒滅菌了幾次？6次連續劃線法分區劃線法劃3個平板（重復實驗）1個不劃線（空白對照）1）一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；2）存留在劃破處的單個細胞無法形成規則的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。“平板劃線”實驗操作1.在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環溫度太高，殺死菌種。2.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。3.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時,仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？灼燒時期目的取菌種前每次劃線前接種結束后殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞殺死接種環上原有微生物【歸納總結】平板劃線法接種菌種時，可防止雜菌污染的操作①接種前將接種環放在酒精燈火焰上灼燒。②劃線操作在酒精燈火焰旁進行。③接種環蘸取菌液前后，要將試管口通過火焰。④劃線時將培養皿的皿蓋打開一條縫隙，用接種環在培養基表面迅速劃線，劃線后及時蓋上皿蓋。方法步驟3.培養酵母菌

完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養箱中培養24-48h。既可以防止培養基表面的水分揮發；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染作對照，該培養皿無菌落說明培養基沒有污染方法步驟4.結果