水產品獸藥殘留檢測技術

編輯ppt主要內容獸藥殘留概述前處理技術液質分析殘留方法的建立步驟方法驗證能力驗證思路和經驗編輯ppt水產品獸藥殘留分析概述

獸藥殘留（animaldrugresidues）是指給動物使用藥物后蓄積或貯存在細胞、組織或器官內的藥物原形、代謝產物和藥物雜質。編輯ppt水產品獸藥殘留分析概述

農業(yè)部193號公告獸藥禁用清單有21類，包括硝基呋喃類，孔雀石綠類，氯霉素類，汞制品類等，出口水產品重點監(jiān)測的獸藥還包扣磺胺類，喹諾酮類，大環(huán)內酯類，青霉素類，四環(huán)素類等。出口指定的獸藥檢測項目要求不得檢出。編輯ppt水產品獸藥殘留分析概述獸藥殘留超標的主要原因1、非法使用違禁藥品2、不遵守休藥期，《中國獸藥典》。3、其他原因如飼料加工的交叉污染，動物個體代謝差異等。編輯ppt水產品獸藥殘留分析概述

對獸藥殘留實施監(jiān)控是一種復雜的系統(tǒng)工程，包括從藥物研制、注冊登記、生產、使用及食品和環(huán)境監(jiān)測等諸多環(huán)節(jié)。建立殘留分析方法和制定最高殘留限量、休藥期是最基本的方面。目前國內頒布的法定檢測方法還缺乏系統(tǒng)性和完善性，其他危害性比較大，特別是出口歐盟產品必須要檢測的品種如抗甲狀腺制劑、類固醇類、硝基咪唑類藥物、精神類藥物、抗蠕蟲藥物、環(huán)境污染物等的檢測方法尚在研究之中。

2002年農業(yè)部再次對已發(fā)布的獸藥最高殘留限量標準進行了修訂并重新發(fā)布，此次共規(guī)定了134種獸藥的《動物性食品中獸藥最高殘留限量標準》。隨著獸藥科技的發(fā)展，新獸藥品種還會不斷出現(xiàn)，因此需要不斷地制定和修訂在水產品的獸藥最高殘留限量規(guī)定及相應的殘留檢測方法。編輯ppt獸藥殘留檢測概述

獸藥殘留檢測涉及到穩(wěn)定性試驗方法，提取方法，凈化方法，測定方法(分離方法檢測方法)。編輯ppt1.文獻檢索文獻檢索僅能顯示最適宜的分析方法可能是什么，提供樣品處理，分離和檢測方面粗略信息，進行方法的比較和借鑒，調整具體的實驗條件，改進和建立符合要求的新方法。如針對新對象或采用新技術，可以從較早的化學合成文獻得到待測物的物理性質或分離方面的原始資料，或從具有相近結構或官能團化合物的方法方法中獲得某些信息和提示。有現(xiàn)成標準方法的采用現(xiàn)成標準方法（驗證）。2.建立測定方法建立測定方法和線性范圍，為后續(xù)的各種工作提供分析手段，最后根據干擾和使用情況逐步確立測定條件和建立標準曲線。如獸殘及代謝物屬中等極性或較高極性化合物，不能直接進行GC分析，HPLC常用的檢測器有紫外（UVD），熒光（FLD，共軛雙烯）,電化學（EehlD）。MS為非常規(guī)檢測器。獸藥殘留檢測概述編輯ppt3.建立樣品處理方法提取，凈化，衍生4.標準曲線

LC-MS/MS要求設4個點，相關系數大于0.995，有外標（基質匹配法）和內標，標準加入法，基質匹配法。5.穩(wěn)定性試驗一般包括標準溶液（溶劑）和樣品中貯存條件下的穩(wěn)定性試驗，如室溫，冷凍，反復冷凍-解凍條件下的穩(wěn)定性。6.方法評價準確度，精密度，靈敏度等。獸藥殘留檢測概述編輯ppt

樣品處理方法涉及的因素很多，操作復雜，方法靈活，直接影響各項分析指標、成本和效率，一般占70%的分析工作量。水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt

常用的提取溶劑有乙腈，甲醇，丙酮，這些溶劑與水，稀酸，稀堿的混合溶劑如乙腈-甲醇，氯仿-甲醇，乙腈-水，或酸化，堿化等。乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚和叔丁基甲醚。叔丁基甲醚可代替鹵代溶劑。

1、提取溶劑的選擇

水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt乙腈，甲醇，丙酮與樣品容易結合，溶劑化作用和滲透能力強，粘度小，提取速度快，能使結合態(tài)的藥物釋放，提取的同時脫蛋白脫脂，PH值可調，待測物分布均勻。但提取的雜質較多，進一步萃取乳化嚴重，效果相似，甲醇提取液的雜質最高。“萬能溶劑”DMSO沸點高極少用。在酯溶性的殘留物中，采用非水溶性極性溶劑，乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚。加無水硫酸鈉，鹽析提高回收率。干樣（含水小10%）加水增強提取。

1、提取溶劑的選擇

編輯ppt均漿提取法；震蕩法；索氏提取法（考慮熱穩(wěn)定性，適合水分少如飼料樣品，水產品組織要和海砂或無水硫酸鈉一起研磨成干粉）；超聲波提取（SAE，空化作用，增加溶解，時間不能長，發(fā)熱）；超臨界流體萃取（SFE），強化溶劑萃取（ASE）和微波輔助萃取（MAE）2、提取方法

水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt超臨界流體密度與液體相似，但是溶質在其中的擴散系數比液體中大得多。極性低的碳氫化合物，醚，酯，環(huán)氧化合物，可以在低壓力下提取（7-10MPa）進行萃取，羥基，羧基難萃取，一個羧基和兩個羥基的化合物和三個酚羥基的苯環(huán)衍生物可以被萃取；40MPa以下，糖和氨基酸都不能被萃取；分級極性差異和揮發(fā)性差異。2、提取方法

水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt

超臨界流體萃取儀—流體源，加壓裝置，控溫裝置，萃取容器，節(jié)流裝置，收集裝置。CO2作為流體操作溫度低，利于熱不穩(wěn)定的化合物，組分中不含氧，防止氧化。2、提取方法

水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt液-液萃取LLELLE利用待測組分與樣品雜質在互不相溶的兩相中溶解性差異進行凈化。設計的基礎為：極性組分與非極性組分；極性物質再分成酸性，中性，堿性物質。正己烷（石油醚）-乙腈；正己烷-甲醇；正己烷-丙酮；異辛烷-80%丙酮；氯仿-水；乙酸乙酯-水。影響因素：溶劑，PH值（磺胺，喹諾酮，苯并米唑類，苯乙胺類等）3、凈化方法水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt液-液萃取操作方法分液漏斗震蕩，漩渦萃取，逆流萃取，特殊容器萃取。從水相中提取藥物時溶劑中常帶如少量的水分，可干擾固相萃取，延長濃縮時間和增加雜質，加無水硫酸鈉脫水。高極性的藥物在凈化中發(fā)生吸附，硅烷化玻璃器皿（1%三甲基氯硅烷的甲苯溶液淌一次，100℃下干燥30min）；加異丙醇或二乙胺也能降低吸附。3、凈化方法水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt固相萃取（SPE）采用固相萃取小柱作為分離媒介，小柱中添加了不同填料的固定相，以鍵合硅膠為基質的C18、NH2、COOH、PSA、SAX等，是硅膠的表面活性大為降低，最大程度的降低了極性化合物的不可吸附和拖尾，使樣品回收率和重現(xiàn)性得到保障；以高分子聚合物為基質的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高純度、高比表面的特點；以吸附型填料為固定相的如硅酸鎂、氧化鋁等，主要通過表面的極性吸附達到分離的目的。因此，固相萃取法適用于各種極性的化合物

3、凈化方法水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt固相萃取（SPE）

3、凈化方法水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt固相萃取（SPE）操作步驟：活化，上樣，洗滌，洗脫。其他方法固相微萃取：固液吸附平衡制備色譜法：制備HPLC分析激素殘留凝膠滲透色譜法：分子篩作用膜分離技術：硝酸纖維，醋酸纖維等半透膜基質固相分散技術：樣品和填料的比例是1：4免疫親和色譜：連接有抗體的惰性基質做固定相，選擇性吸附。分子印跡技術：印跡聚合物，塑料抗體

3、凈化方法水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt

旋轉蒸發(fā)：溶劑可回收氣流吹蒸：少量溶劑K-D濃縮器：濃縮，回流，洗滌，定容真空離心：熱敏性組分，粘稠液體再溶解使用流動相的初始比例作溶劑4、濃縮富集及再溶解水產品獸藥殘留檢測樣品前處理技術編輯ppt步驟1.確立質譜條件2.建立LC方法3.內標選擇4.前處理方法選擇建立液相色譜串聯(lián)質譜定量分析方法編輯ppt

文獻檢索：了解化合物的性質包括化合物的結構、化合物的極性及化合物的pKa值。首先了解化合物的結構，可大概的推斷其碎片離子的斷裂方式，選擇較為穩(wěn)定的碎片離子作為定量的子離子，也可以根據經驗判斷選用哪種離子源更為合適；根據化合物的極性大小，可以選擇一種或幾種恰當的溶劑作為溶媒，既能保證完全將樣品溶解，又能提高化合物的質譜響應；化合物的pKa值，有助于選擇流動相的添加劑及其pH值，從而提高質譜響應。

建立液質定量分析方法編輯ppt建立液質定量分析方法編輯ppt1.連接管路2.選擇Q1MS掃描模式和FullScan掃描類型3.設置離子源參數4.將流動相導入質譜儀，觀察到待測化合物的準分子離子峰峰強度在10的6次方左右。1、確立質譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質定量分析方法編輯ppt5.選擇MSOnly優(yōu)化模式和SyringePumpInfusion入口類型選項6.優(yōu)化TubeLensOffset、SprayVoltage、SheathGasPressure、AuxGasPressure獲得待測化合物穩(wěn)定的準分子離子峰。7.選擇MS+MS/MS優(yōu)化模式設置ParentMass、ChargeState和NumProduct對子離子進行優(yōu)化。8.MRM優(yōu)化模式優(yōu)化TubeLensOffset和CollisionPressure9.記錄并保存子離子全掃描質譜圖。保存TuneMethod文件。

1、確立質譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質定量分析方法編輯ppt1、確立質譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質定量分析方法編輯ppt1、確立質譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質定量分析方法編輯ppt2、確立LC條件在液相-紫外檢測中，使用的添加劑的種類繁多，可以是揮發(fā)性的酸或者堿（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易揮發(fā)的緩沖鹽（如磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液、磷酸二氫鉀-磷酸緩沖鹽）。但是在液質分析中，基于質譜檢測的原理，我們只能使用可揮發(fā)的酸堿或緩沖鹽，那么種類就會受到極大的限制。在日常分析中使用到的添加劑主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸銨、乙酸銨等緩沖鹽。三乙胺在紫外檢測中，常作為掃尾劑，但是在液質檢測中是絕對禁止的。因為三乙胺進入質譜后不易清除，殘留及其嚴重，能夠抑制離子的響應。在液相色譜紫外檢測中，要求化合物之間R≥1.5，進行定量，那R最好≥2.0，要求準確的配制流動相，精確的調好流動相的pH及添加劑的濃度。但在液質分析中，我們經常使用多反應監(jiān)測（MRM/SRM）對化合物進行定量，由于MRM要求選擇兩次離子，因此它具有很高的專屬性，基于這點我們對多個化合物同時進行檢測時，不需要彼此間達到完全分離就可以對他們進行定量分析。建立液質定量分析方法編輯ppt2、確立LC條件由于生物樣品中含有大量的基質，這些基質的存在會嚴重的干擾和影響化合物的測定，因而我們需要利用色譜將化合物與基質分開，從而降低基質效應的影響，即降低離子抑制。待測化合物要在色譜柱上有保留，并且適當延長保留時間。三聚氰胺最好用離子柱。建立液質定量分析方法編輯ppt3、內標選擇內標工作方式：在每個樣品、標準和空白中加入測定到每個樣品中內標的響應根據實際測定內標響應值與預期內標響應值的比值來校正其他化合物的信號用分析信號和內標的比作標準曲線或乘校正因子或除內標回收率計算未知樣品的分析信號和內標的比值并從標準曲線中讀出信號建立液質定量分析方法編輯ppt3、內標選擇1.樣品中不存在或者可以忽略2.沒有受到質譜干擾3.沒有對分析對象產生質譜干擾4.不容易受到環(huán)境污染5.和分析對象質量數接近（氘代物）6.離解方式和分析對象接近建立液質定量分析方法編輯ppt能力驗證經驗及基質效應為什么要采用LC-MS考核化合物的含量越來越低基體越來越復雜藥殘的能力驗證建議的第一方法例如：干魚粉中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星魚肉中的氟苯尼考編輯ppt能力驗證經驗及基質效應

考核中的質量控制方法控制樣品空白平行雙樣測定或三樣加標回收標準參考物質的同步分析重復測定和儀器比對編輯ppt能力驗證經驗及基質效應

加標回收：可分為前處理加標回收和上機加標（單點標準加入）編輯ppt能力驗證經驗及基質效應

加標回收：可分為前處理加標回收和上機加標（單點標準加入）加標回收接近100％不能代表考核結果完全準確無誤。不能檢查標準物質本身所帶來的誤差；不能檢查加和性干擾，如污染和質譜干擾；編輯ppt能力驗證經驗及基質效應標準參考物質的同步分析：選擇基體和濃度相似的標準參考物質同步進行分析作用：標準是否合格樣品前處理是否合適測定中是否存在干擾目前藥殘的標準參考物質很難購買，對于固體的國家一級標準物質，即使不能購得，也要盡量收集到證書。編輯ppt能力驗證經驗及基質效應其他質控方法不同儀器的比對實驗不同儀器在一定程度可考察基體和質譜的干擾狀況重復分析和人員比對實驗盡量消除過失誤差和隨機誤差以上的質量控制方法在考核中應盡量多采用編輯ppt能力驗證經驗及基質效應考核前準備確認色譜柱柱效各流動相充足清洗錐口重新調諧校正儀器總之就是使儀器處于良好狀態(tài)編輯ppt能力驗證經驗及基質效應預試驗稀釋到一定(或要求)的倍數后測定稀釋成多種稀釋倍數有利于多項目的測定使?jié)舛仍跇藴是€的中間點有利于發(fā)現(xiàn)干擾有利于防止污染編輯ppt能力驗證經驗及基質效應定容要考慮溶劑的匹配。測定每個樣品測定2

3次，同時分析標準參加物質并分析加標樣品。數據處理查看校準曲線是否符合要求確定是不同質量數測定結果是否相同盡量不同超過標準曲線的范圍，如超過應稀釋后測定。編輯ppt能力驗證經驗及基質效應基質效應成因待測組分與基質中內源性物質共洗脫而引起的色譜柱超載所致，這些成分常因在色譜分析中與目標化合物分離不完全或未被檢測到而進入質譜后產生基質效應。待測組分與生物樣品中的基質成分在霧滴表面離子化過程中的競爭。由于基質中某些干擾組分的存在會使待測組分離子生成的速度同標準樣品相比有顯著不同，使得信號響應值產生較大變異。離子的有效淌度受到周圍離子的影響，由其周圍離子所形成的包圍圈，稱為離子基體。如果樣品組分從進樣點到探測點遷移過程中，在某一時間間隔遇上一個不同組成的基體區(qū)帶，這個離子基體區(qū)帶就將對樣品組分產生影響，使它們的淌度發(fā)生瞬時變化，從而選擇性地影響溶質的遷移和分離，這就是瞬時離子基體效應。分為離子抑制和離子增強

編輯ppt能力驗證經驗及基質效應基質效應的評價：

1.用流動相配制高中低三個濃度的待測物，并加入內標，測得響應值。

2.空白基質提取后加入相同濃度的待測物和內標，測響應值。

基質效應=空白基質響應值/流動相響應值×100％

這樣不同濃度的待測物的基質效應和內標的基質效應均可得到。

編輯ppt能力驗證經驗及基質效應基質效應消除方法

1.選擇合適的樣品制備方法，對于不同的樣品制備方法，不能簡單地說某種方法優(yōu)于另一種方法，每種組分對基質效應的敏感度不同，其適宜采用的樣品制備方