ICS07.080CCSC27中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞純度測(cè)定通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法GF2020-12-14發(fā)布2021-07-01實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB／T39729—2020 1范圍 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ) 4方法原理 5通用要求 5.1試劑或材料 5.2儀器設(shè)備 5.3樣本制備 5.4試驗(yàn)步驟 5.5數(shù)據(jù)分析 5.6方法確認(rèn) 參考文獻(xiàn) ⅠGB／T39729—2020本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。ⅡGB／T39729—2020細(xì)胞純度是評(píng)價(jià)和分析細(xì)胞樣本特性與細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量的基本參數(shù)，因此醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、生物醫(yī)藥研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量檢驗(yàn)等領(lǐng)域需要廣泛開(kāi)展細(xì)胞純度的測(cè)量。流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)液體中懸浮單顆粒或細(xì)胞進(jìn)行高速、多參數(shù)分析，是一種常用的細(xì)胞純度測(cè)量方法。為了實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室、平臺(tái)、操作人員等測(cè)量系統(tǒng)條件之間的數(shù)據(jù)一致性，需要對(duì)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞純度試驗(yàn)的技術(shù)環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)化。1GB／T39729—2020細(xì)胞純度測(cè)定通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法本文件描述了流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞純度的術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)、方法原理，以及包括試劑或材料、儀器設(shè)備、樣本制備、試驗(yàn)步驟、數(shù)據(jù)分析、方法確認(rèn)和報(bào)告的通用要求。本文件適用于研究、生產(chǎn)與檢驗(yàn)中通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行的細(xì)胞純度的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。與檢測(cè)目標(biāo)相一致，具有流式細(xì)胞儀可檢測(cè)特征（如大小、數(shù)量、特定標(biāo)志物）的細(xì)胞。3.1.2目標(biāo)細(xì)胞占樣本總細(xì)胞數(shù)量的百分率。3.1.3細(xì)胞特定成分與熒光染料或標(biāo)記了熒光染料的特異性抗體結(jié)合后進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)。注：特定成分為蛋白質(zhì)、DNA、RNA等。下列縮略語(yǔ)適用于本文件。4方法原理使用流式細(xì)胞儀，通過(guò)總細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞不同的光學(xué)（散射光和熒光）特性，對(duì)待測(cè)樣本中的總細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)。根據(jù)總細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞的測(cè)量數(shù)量，計(jì)算得到目標(biāo)細(xì)胞純度。2GB／T39729—20205通用要求選擇的熒光染料應(yīng)能被試驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀的激光器激發(fā)，其激發(fā)光信號(hào)能被流式細(xì)胞儀的檢測(cè)器接收。5.1.2熒光染料標(biāo)記的抗體確保選擇的熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)目標(biāo)細(xì)胞具有特異性。要求。緩沖溶液不應(yīng)造成待測(cè)細(xì)胞的破裂、形態(tài)嚴(yán)重改變或者聚團(tuán)，不應(yīng)對(duì)待測(cè)細(xì)胞的光學(xué)特性產(chǎn)生顯著影響，一般為不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液，配制要求和方法應(yīng)根據(jù)具體細(xì)胞類型確定。固定劑不應(yīng)造成待測(cè)細(xì)胞染色后的光學(xué)特性和形態(tài)嚴(yán)重改變。熒光補(bǔ)償樣品為單熒光染色細(xì)胞或者熒光補(bǔ)償微球。熒光補(bǔ)償樣品的熒光染料應(yīng)與待測(cè)細(xì)胞所用的熒光染料一致。熒光補(bǔ)償樣品的熒光強(qiáng)度至少要與待測(cè)細(xì)胞一致，或者超過(guò)待測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。具有熒光檢測(cè)通道和散射光檢測(cè)通道，熒光通道能夠檢測(cè)選擇的熒光染料，散射光檢測(cè)通道包括流式細(xì)胞儀應(yīng)經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)，并定期核查準(zhǔn)確性和精密度。度和精密度。時(shí)長(zhǎng)等條件。用于細(xì)胞染色的孵育溫度控制或試劑、樣本的保存，例如冰箱。使用者應(yīng)監(jiān)測(cè)并記錄溫度控制裝置3GB／T39729—2020的溫度準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。5.3樣本制備根據(jù)原始樣本的類型選擇合適的待測(cè)樣本制備方式。待測(cè)樣本應(yīng)是單分散細(xì)胞懸液，即待測(cè)樣本中的細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞存在，沒(méi)有細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞碎片。運(yùn)送條件不應(yīng)影響待測(cè)細(xì)胞的生物特性和檢測(cè)結(jié)果。待測(cè)樣本應(yīng)具有標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明樣本類型、樣本采集和制備的時(shí)間和地點(diǎn)。細(xì)胞染色前，應(yīng)根據(jù)流式細(xì)胞儀的性能參數(shù)、待測(cè)細(xì)胞的黏附、自然沉降等特性來(lái)調(diào)整樣本中的細(xì)胞濃度。如果細(xì)胞濃度過(guò)高，可用緩沖溶液對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)。根據(jù)熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體質(zhì)量參數(shù)確定樣本量及染料、抗體濃度、孵育條件。保證待測(cè)樣本和熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體充分混合，應(yīng)選擇合適的渦旋轉(zhuǎn)速和時(shí)長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成細(xì)胞破損。待測(cè)樣本完成細(xì)胞染色后，應(yīng)盡快進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。如果無(wú)法盡快上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)通過(guò)固定劑進(jìn)行固定5.4試驗(yàn)步驟應(yīng)根據(jù)流式細(xì)胞儀的儀器說(shuō)明書(shū)設(shè)置儀器的工作條件，包括環(huán)境溫度、濕度、電源電壓、大氣壓力、環(huán)境光照等。每次開(kāi)機(jī)后，對(duì)流式細(xì)胞儀的光路系統(tǒng)進(jìn)行校驗(yàn)，可參考流式細(xì)胞儀的校驗(yàn)參數(shù)檢測(cè)FSC、SSC和各熒光通道的平均熒光強(qiáng)度、變異系數(shù)和熒光分辨率。5.4.3細(xì)胞純度的測(cè)量應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、同型對(duì)照、熒光扣除對(duì)照，用于識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞并確認(rèn)目標(biāo)細(xì)胞的染色方案是否正確。使用不含任何熒光染料的待測(cè)細(xì)胞樣本作為陰性對(duì)照。使用已經(jīng)證明可有效地與待測(cè)熒光染料結(jié)合的細(xì)胞樣本作為陽(yáng)性對(duì)照。使用與熒光染料標(biāo)記的抗體相同種屬來(lái)源、同種免疫球蛋白的相同亞型的相同劑量抗體染色的細(xì)胞樣品作為同型對(duì)照。使用兩個(gè)和兩個(gè)以上的熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體組合標(biāo)記細(xì)胞樣本時(shí)，在完整的染色基礎(chǔ)上4GB／T39729—2020使用減少一種熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體進(jìn)行細(xì)胞染色的待測(cè)細(xì)胞樣本作為熒光扣除對(duì)照。進(jìn)樣間隔期間，應(yīng)使用清洗液對(duì)儀器管道進(jìn)行清洗。選擇合適的檢測(cè)通道后，根據(jù)使用的熒光染料或相關(guān)試劑盒提供的質(zhì)量參數(shù)設(shè)置系列雙參數(shù)散點(diǎn)圖或單參數(shù)直方圖和閾值。照、陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞FSC、SSC信號(hào)與細(xì)胞碎片或雜質(zhì)分開(kāi)處于對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖中部，見(jiàn)圖1。圖中對(duì)應(yīng)熒光通道強(qiáng)度軸閾值的下方，或單參數(shù)直方圖中對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度軸閾值的左方，見(jiàn)圖2。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：Q1—陰性對(duì)照；Q2—陽(yáng)性對(duì)照。圖2流式分析圖譜中陰性／陽(yáng)性對(duì)照的熒光通道信號(hào)類群區(qū)分示意圖采用兩種及以上染料組合方案進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)或光學(xué)檢測(cè)通道的電壓及增益發(fā)生變動(dòng)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行熒光補(bǔ)償。熒光補(bǔ)償樣品進(jìn)樣完成后，根據(jù)儀器操作軟件的指示進(jìn)行手工方式補(bǔ)償或自動(dòng)補(bǔ)償。5GB／T39729—2020使用同型對(duì)照和熒光扣除對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)相應(yīng)散點(diǎn)圖中的熒光強(qiáng)度表達(dá)，從陽(yáng)性對(duì)照的熒光信號(hào)中區(qū)分出目標(biāo)細(xì)胞的陽(yáng)性信號(hào)并進(jìn)行設(shè)門。應(yīng)在進(jìn)樣穩(wěn)定后開(kāi)始采集信號(hào)。總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量不應(yīng)小于10000，目標(biāo)細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量不應(yīng)小于1000個(gè)。若總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量為10000時(shí)，不能獲取1000個(gè)目標(biāo)細(xì)胞采集數(shù)量，可加大總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量。信號(hào)采集時(shí)間應(yīng)保持在合理范圍內(nèi)，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生聚集或沉降。5.5數(shù)據(jù)分析按照公式（1）計(jì)算目標(biāo)細(xì)胞純度：式中：P—目標(biāo)細(xì)胞純度；Nt—總細(xì)胞數(shù)量，單位為個(gè)。應(yīng)對(duì)具體測(cè)量方法進(jìn)行方法性能確認(rèn)。方法性能參數(shù)包括準(zhǔn)確度、精密度、工作范圍（檢出限、線性范圍等）、特異性、方法穩(wěn)健性和組間精密度（如操作者間、儀器間和日間變化）等。可建立評(píng)估方法性能參數(shù)的方案和標(biāo)準(zhǔn)，制定并保存相應(yīng)的文件。報(bào)告提供的信息應(yīng)至少包括：6GB／T39729—2020