目前，CAR-T療法已經(jīng)在血液惡性腫瘤方面取得了成果，但在實(shí)體瘤上還面臨著相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。這種對實(shí)體瘤療效不佳的原因可能包括已知的腫瘤特異性抗原數(shù)量有限、T細(xì)胞在到達(dá)腫瘤部位之前的持久性和適應(yīng)性有限、實(shí)體瘤滲透性差和免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）而影響CAR-T療效的參數(shù)也有很多，包括靶點(diǎn)、CAR結(jié)構(gòu)、劑量等。CAR-T和其他過繼性療法（ACT）的早期研究和臨床試驗(yàn)主要集中在細(xì)胞劑量上，而沒有描述T細(xì)胞的特定表型。不過，T細(xì)胞療法通常由眾多在參數(shù)上不同的異質(zhì)細(xì)胞組成，如記憶分化特征、活化和耗竭狀態(tài)、細(xì)胞因子釋放特征等。這些變量中的任何一個(gè)都會影響T細(xì)胞的功能，包括靶向和遷移到腫瘤的能力、細(xì)胞因子釋放、細(xì)胞溶解活性等。一、CAR-T療法優(yōu)化方向1.1記憶T細(xì)胞潛能CAR-T治療效果的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是轉(zhuǎn)移性T細(xì)胞的記憶潛能。在抗原刺激后，初始T細(xì)胞（NaiveTcell，TN）迅速分裂（一周內(nèi)高達(dá)50000倍）為記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T（Teff）細(xì)胞，以清除被感染的細(xì)胞。其中，記憶T細(xì)胞包括幾種亞型：干細(xì)胞記憶T（TSCM）細(xì)胞、中央記憶T（TCM）細(xì)胞和效應(yīng)記憶T（TEM）細(xì)胞，依次分化程度越高，增殖潛力降▲不同表型細(xì)胞特性（圖片來源：參考資料1）臨床前研究表明，經(jīng)過基因工程改造能夠特異性靶向腫瘤的T細(xì)胞群中，含有較高比例的TN和TCM會增強(qiáng)抗腫瘤功效。在CAR-T細(xì)胞療法中也觀察到了相似的趨勢，較高比例的TN、TSCM、TCM細(xì)胞在動物模型、患者來源的樣本和臨床試驗(yàn)中均能夠有效提高抗腫瘤療效，這可能與這些細(xì)胞較Teff而言具有更高的增殖潛力有關(guān)，這樣能夠保持更好的持久性和達(dá)到峰值反應(yīng)時(shí)更高的細(xì)胞數(shù)。此外，這些細(xì)胞群能夠釋放更高水平的抗腫瘤細(xì)胞因子，具有較高的活化標(biāo)記（如CD28）表達(dá)和較低的耗竭標(biāo)記（如TIGIT、LAG3、PD-1）的表達(dá)。一般來說，T細(xì)胞的分化在很大程度上是線性和單向的，將T細(xì)胞阻滯在早期分化階段可能是誘導(dǎo)更有效和持久的抗腫瘤反應(yīng)的方法。根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記物以及培養(yǎng)基存在的細(xì)胞因子分析可以用于選擇出某種類型的記憶細(xì)胞，其中后者可以通過采用在培養(yǎng)基中加入磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑來實(shí)現(xiàn)，這也是臨床上最先進(jìn)的方法之一。BMS研發(fā)代號為bb21217的BCMACAR-T療法采用的就是這個(gè)策略，相較于其Abecma產(chǎn)品而言，bb21217富集了更多記憶型CAR-T細(xì)胞，有望使得患者達(dá)到更好的預(yù)期。不過，考慮到在沒有PI3K抑制劑的情況下，BCMACAR-T療法在MM中的總體有效率很高，且Abecma已順利獲批，要將bb21217進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化以及證明其臨床改善具有挑戰(zhàn)性，故而BMS和2seventyBio宣布不再做進(jìn)一步開發(fā)。1.2CD4:CD8比率最終T細(xì)胞產(chǎn)物的CD4:CD8比率被認(rèn)為是治療效果的關(guān)鍵。CD4+T細(xì)胞對于激活和維持細(xì)胞毒性T細(xì)胞、誘導(dǎo)記憶反應(yīng)有重要作用；CD8+T細(xì)胞的增殖能力較CD4+T強(qiáng)。CD4:CD8比例平衡的CAR-T療法共定位能力增強(qiáng)，總體抗腫瘤反應(yīng)增強(qiáng)。這種協(xié)同作用可能是由腫瘤部位的CD4+T細(xì)胞分泌的Th1細(xì)胞因子引發(fā)的。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，平衡的CD4:CD8比例既能夠增加完全緩解率，同時(shí)使用的細(xì)胞劑量減少5-100倍。Breyanzi就是以固定的CD4:CD8比率制造的，通過交叉試驗(yàn)比較，該產(chǎn)品的應(yīng)答率與其他抗CD19CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品相當(dāng)，但細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）水平較低。1.3優(yōu)化患者預(yù)處理方式T細(xì)胞輸注之前用淋巴細(xì)胞靶向劑如環(huán)磷酰胺（Cy）、氟達(dá)拉濱（Flu）、抗CD52抗體或苯達(dá)莫司汀進(jìn)行預(yù)處理是ACT增殖和植入的必要條件。目前的預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)是Flu和Cy組合，大約從ACT輸注前5天開始。但這些藥物的給藥差異或替代藥物的使用是否會改善CAR-T的活性和毒性仍在研究當(dāng)中，在一項(xiàng)回顧性分析中，接受tisagenleucel治療的患者以使用Flu和Cy作為對照組，發(fā)現(xiàn)使用苯達(dá)莫司汀具有相同效果，但毒性有所改善。此外，預(yù)處理還具有其他有益作用，包括對腫瘤微環(huán)境（TME）的直接影響，有可能通過重塑TME與ACT的協(xié)同作用，以獲得更好的T細(xì)胞浸潤和更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。在研發(fā)CAR-T療法的同時(shí)，通過優(yōu)化預(yù)處理方案或許能夠取得更加理想的效果。1.4優(yōu)化激活信號1/2/3目前的ACT的制造依賴于來自患者的分離的T細(xì)胞的離體激活和擴(kuò)增，T細(xì)胞激活需要三個(gè)信號：T細(xì)胞受體結(jié)合（信號1）、與共刺激分子結(jié)合（信號2）、引導(dǎo)和擴(kuò)增T細(xì)胞分化和擴(kuò)增的細(xì)胞因子（信號3）。這三種信號都在控制T細(xì)胞的表型和功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。優(yōu)化ACT的策略包括調(diào)控這三個(gè)關(guān)鍵信號、調(diào)節(jié)下游信號通路等?？扇苄约有钥贵w和人工抗原呈遞細(xì)胞（APC）常用于提供信號1和2。有研究表明，CD3/CD28抗體能夠誘導(dǎo)更高的T細(xì)胞受體表達(dá)和增強(qiáng)腫瘤殺傷作用；構(gòu)建人工APC的材料會影響T細(xì)胞受體，其大小和形狀會影響CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)。此外，還有多種藥物被探索作為刺激分子，如4-1BB刺激能夠延長CD27和CD28表達(dá)，能夠優(yōu)先擴(kuò)增抗原反應(yīng)性記憶細(xì)胞，誘導(dǎo)更多細(xì)胞溶解，延長T細(xì)胞持久性，與CD3/CD28共刺激聯(lián)合時(shí)，可以保留TCM▲信號1和2（圖片來源：參考資料1）除了在培養(yǎng)基中添加可溶性激動性抗體外和使用人工APC外，已經(jīng)開發(fā)出了寡核苷酸適配體，并被證明可以有效激活T細(xì)胞，這些適配體提供了一種潛在的更便宜、更容易制備的抗體替代方案，并被開發(fā)用于靶向其他共刺激信號通路。T細(xì)胞的擴(kuò)增和分化可以通過多種細(xì)胞因子介導(dǎo)，其中細(xì)胞因子受體γ鏈(γc）家族是研究最廣泛的細(xì)胞因子之一，包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-21等，具有調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，共同促進(jìn)各種免疫細(xì)胞群發(fā)展的作用。而非γc細(xì)胞因子也已被發(fā)現(xiàn)會影響CAR-T功效。優(yōu)化體外T細(xì)胞制造的細(xì)胞因子數(shù)量、組合能夠或許是提高CAR-T有效性的一個(gè)方1.5調(diào)節(jié)下游信號通路通過控制T細(xì)胞激活信號下游的信號通路可以直接調(diào)節(jié)T細(xì)胞表型，這一策略主要針對PI3K–AKT–mTOR、Notch、WNT–β-catenin、MAPK/ERK等主要通路和T細(xì)胞代謝。阻斷PI3Ks、AKT1/2和mTOR，調(diào)節(jié)mTORC1的PIM激酶都已被證明能夠產(chǎn)生具有TSCM和TCM細(xì)胞特性的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤毒性。針對信號通路的調(diào)節(jié)，可以在培養(yǎng)基中添加對應(yīng)物質(zhì)以重編程T細(xì)胞代謝，如加入L-精氨酸增強(qiáng)T細(xì)胞存活和抗腫瘤活性，添加醋酸鹽可以增強(qiáng)乙酰化作用，在T細(xì)胞處于激活狀態(tài)時(shí)增強(qiáng)效應(yīng)器功能。不過在調(diào)節(jié)下游信號通路的途徑中可能會涉及到影響多種細(xì)胞功能，且在不同的時(shí)間與細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用，故而直接操作這些途徑來調(diào)節(jié)T細(xì)胞表型時(shí)還需慎二、臨床供應(yīng)的三大考量與CAR-T細(xì)胞制造過程相關(guān)的技術(shù)，特別是與激活和擴(kuò)增相關(guān)的技術(shù)，仍處于早期開發(fā)階段。通過自動化技術(shù)擴(kuò)大CAR-T的生產(chǎn)是一個(gè)迫切的需求，自動化平臺保證了更好的細(xì)胞活力、更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和更低的細(xì)胞亞群變異，減少對技術(shù)人員和科學(xué)家的依賴，能夠促進(jìn)商業(yè)化和患者的可及性，同時(shí)將生產(chǎn)時(shí)間減少30%-40%。此外，開發(fā)端到端的生產(chǎn)系統(tǒng)可以促進(jìn)建立分散式CAR-T制造。目前的CAR-T療法使用集中生產(chǎn)模式，一個(gè)符合生產(chǎn)規(guī)范（GMP）要求的生產(chǎn)基地為多個(gè)臨床中心提供服務(wù)。盡管這種集中式系統(tǒng)可能會簡化多個(gè)患者并行產(chǎn)品的生產(chǎn)，但它也大大增加了物流和配送方面的挑戰(zhàn)。模塊化、小型化和步驟集成，包括但不限于病毒生產(chǎn)、離體T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、活化和擴(kuò)增以及質(zhì)量控制，將使在治療中心制造CAR-T的自動化、端到端解決方案成為可能。這種分散化模式可以提高CAR-T的總生產(chǎn)能力，減少CAR-T制備時(shí)間擴(kuò)大CAR-T生產(chǎn)的一個(gè)挑戰(zhàn)是在患者材料收集、制造、治療中心的過渡，可能會涉及試驗(yàn)不同產(chǎn)品標(biāo)識符、患者信息在制造過程中丟失等問題，這需要建立一個(gè)“數(shù)字供應(yīng)鏈”，減少交付周期并確保CAR-T產(chǎn)品可以精確交付。2.2副作用CAR-T在回輸給患者后，可能會誘導(dǎo)明顯的副作用，包括細(xì)胞因子釋放綜合征和免疫效應(yīng)toxilizumab（IL-6R拮抗劑）和類固醇，像利用anakinra等藥物治療還在探索中?？茖W(xué)家正在建立模型和預(yù)測算法，以確定可預(yù)測治療后細(xì)胞因子釋放綜合征和ICANS嚴(yán)重程度的2.3可及性CAR-T制備復(fù)雜，需要專門的設(shè)施和專業(yè)知識，這使得其難以在發(fā)展中國家/地區(qū)實(shí)施，并限制了其在低收入人群中的可用性。不同社會經(jīng)濟(jì)地位的患者在使用CAR-T治療方面存在巨大差異。在美國，只有7.3%的接受CAR-T療法的患者來自低收入社區(qū)，而非洲、南美洲、印度等幾乎沒有CAR-T試驗(yàn)。數(shù)字醫(yī)療可以允許這些患者在線接受后續(xù)護(hù)理，并能夠與距離患者家更近的中心進(jìn)行協(xié)調(diào)以減輕距離CAR-T定點(diǎn)治療區(qū)域較遠(yuǎn)的低收入家庭的負(fù)此外，病毒載體、患者細(xì)胞以及制備好的CAR-T產(chǎn)品均需要冷鏈運(yùn)輸，而中低收入國家缺乏可靠的低溫鏈，其建設(shè)需要大量的資金、設(shè)備以及專業(yè)技術(shù)人員支持，目前仍難以實(shí)現(xiàn)，但一些潛在的替代方面正在被開發(fā)，其中一個(gè)解決方案是使用干冰，不過其無法真正提供與冷鏈完全相同的性能，不是長遠(yuǎn)之計(jì)；另一個(gè)方案是開發(fā)生物保存和冷凍制劑，這有可能減輕在次優(yōu)條件下運(yùn)輸或儲存的風(fēng)險(xiǎn)，減少反復(fù)凍融對細(xì)胞產(chǎn)生的影響。三、總結(jié)盡管CAR-T療法已經(jīng)獲批上市取得重大突破，但其仍然有眾多需要優(yōu)化和改進(jìn)的地方，