動脈粥樣硬化免疫機制

研究進(jìn)展

南華大學(xué)心血管病研究所楊永宗.8.15.-8-151動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第1頁一、前言AS病變炎癥性質(zhì)以及一系列炎性因子在AS病變形成中關(guān)鍵作用幾已成為共識。但數(shù)以百計危險原因怎樣開啟炎癥過程而促成AS病變發(fā)生發(fā)展卻還是個未解問題。

天然免疫模式識別理論提出將開辟AS病變發(fā)生發(fā)展機理研究新領(lǐng)域。-8-152動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第2頁二、天然免疫模式識別理論關(guān)鍵點美國免疫學(xué)家Janeway提出天然免疫模式識別理論，強調(diào)天然免疫對取得性免疫指導(dǎo)和調(diào)控作用，指出抗原遞呈細(xì)胞（APC）是緊密地連接天然免疫與取得性免疫橋梁。天然免疫系統(tǒng)經(jīng)過APC上模式識別受體(PRR)識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)，區(qū)分“自己”與“非己”及無害“非己”和病原體相關(guān)“非己”,并籍抗原遞呈和共刺激信號兩個步驟賦予取得性免疫識別“自己”“非己”能力。-8-153動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第3頁病原相關(guān)分子模式

（pathogen-associatedmolecularpattern）

PAMP是指一大組或某幾大組病原體所共有一個分子模式(moleculepattern)，而非某一特定結(jié)構(gòu)。PAMP是病原體保守結(jié)組成份且對其生存是必要,如發(fā)生突變,將使病原體死亡或喪失致病性。PAMP不一樣于宿主機體本身成份。

-8-154動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第4頁Janeway提出模式識別理論，將天然免疫針正確主要靶分子信號稱為病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP），將其對應(yīng)識別受體稱為模式識別受體（patternrecognitionreceptor,PRR）。PAMP主要指廣泛存在于病原體細(xì)胞表面分子標(biāo)志，如酵母細(xì)胞壁上甘露糖、以及各種細(xì)菌細(xì)胞壁成份如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，這些分子在進(jìn)化過程中都趨于保守。-8-155動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第5頁模式識別受體

(patternrecognitionreceptor)

與PAMP對應(yīng)識別受體稱為模式識別受體（PRR）。已克隆PRRｓ大多屬于Toll樣受體(TLRs)家族,清道夫受體尤其是SR-A1也含有PRR功效。TLRs廣泛表示在各種淋巴細(xì)胞表面，包含非特異性免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞，和特異性免疫Ｔ淋巴細(xì)胞和Ｂ淋巴細(xì)胞。其中單核細(xì)胞分化樹突狀細(xì)胞是唯一表示全部5種TLR細(xì)胞,也是唯一表示TLR3細(xì)胞。

-8-156動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第6頁1.病原微生物感染

相關(guān)病原體研究包含肺炎衣原體、幽門螺旋桿菌、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒等。其中肺炎衣原體在AS斑塊發(fā)生中作用已經(jīng)有較多研究，但現(xiàn)在認(rèn)為單一病原體感染在AS中作用可能很小，而多重感染并存則是影響心血管疾病主要原因。-8-157動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第7頁內(nèi)毒素作用ControlGroupEndotoxinGroup-8-158動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第8頁Group vWF(%) tPAactivity PAIactivity

(Iu/mgprotein) (Au/mgprotein)Endotoxin 0.556±0.048* 0.227±0.048* 5.36±0.28*Control 0.100±0.050 0.643±0.080 1.25±0.40*P<0.05comparedwithcontrol.內(nèi)毒素對內(nèi)皮細(xì)胞功效影響-8-159動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第9頁ControlCoronaryArteryfromPatient

肺炎衣原體-8-1510動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第10頁A1:ControlA2:106IFUs/LAR-39B1:10mg/LLDLB2:10mg/LLDL+106IFUs/LAR-39C1:10mg/LoxLDLC2:10mg/LoxLDL+106IFUs/LAR-39肺炎衣原體對細(xì)胞膽固醇蓄積影響-8-1511動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第11頁A1:對照組A2:cpnB1:LDLB2:LDL+cpnC1:ox-LDLC2:ox-LDL+cpn肺炎衣原體對C57BL/6J小鼠腹膜巨噬細(xì)胞泡沫化影響-8-1512動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第12頁多重感染并存流行病學(xué)資料顯示，冠心病患病危險度與感染病原體種類多少相關(guān)，而且存在各種感染是冠心病患者發(fā)生心肌梗死獨立危險原因。現(xiàn)在認(rèn)為單一病原體感染在AS中作用可能很小，而多重感染并存則是影響心血管疾病主要原因。Circulation.;103:45-51.

ProspectiveStudyofPathogenBurdenandRiskofMyocardialInfarctionorDeath-8-1513動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第13頁

2.氧化修飾低密度脂蛋白A對照組B試驗組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞豬主動脈平滑肌細(xì)胞-8-1514動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第14頁人U937細(xì)胞透射電鏡照片人外周血單核巨噬細(xì)胞人THP-1細(xì)胞-8-1515動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第15頁Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.92,pp.3893-3897,April1995Tlymphocytesfromhumanatheroscleroticplaquesrecognizeoxidizedlowdensitylipoprotein-8-1516動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第16頁AS患者血清和斑塊可檢測到oxLDL抗體。斑塊中分離出CD4+T細(xì)胞可識別oxLDL。oxLDL抗體可分為IgG和IgM型。IgG抗體水平增高與AS病變程度加重相關(guān)，而IgM型oxLDL抗體與AS病變呈負(fù)相關(guān)。-8-1517動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第17頁用oxLDL免疫兔可降低40%～50%AS病變，在apoE和LDLR敲除小鼠研究中也取得類似結(jié)果。Shaw等人用肺炎鏈球菌感染LDLR缺乏小鼠，誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)高水平IgM型oxLDL抗體產(chǎn)生。伴隨脾臟內(nèi)B淋巴細(xì)胞連續(xù)分泌IgM增高，AS病變程度降低。用apoB-100肽鏈免疫apoE缺點小鼠，可降低60%AS病變形成，并特異性增加IgG抗體水平[7]。ArteriosclerThrombVascBiol.;23:879-884.

InhibitionofAtherosclerosisinApoE-NullMicebyImmunizationwithApoB-100PeptideSequences-8-1518動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第18頁斑塊內(nèi)OxLDL可影響DC成熟和活化，氧化過程產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿（LPC）可直接經(jīng)過G蛋白偶聯(lián)受體路徑誘導(dǎo)DC成熟。oxLDL還能夠增加DC表面呈遞抗原以及協(xié)同信號分子表示。TheJournalofImmunology,,169:1688–1695.MatureDendriticCellGenerationPromotedbyLysophosphatidylcholine-8-1519動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第19頁3.熱休克蛋白HSP可與各種抗原肽結(jié)合產(chǎn)生免疫原性，誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)。Berberian最先報道在人類和兔斑塊中存在HSP70，而且HSP分布與斑塊中細(xì)胞壞死、脂質(zhì)聚集相關(guān)。Kleindienst研究表明頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞HSP60表示量與AS嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。斑塊中大量存在T淋巴細(xì)胞對HSP60/65可發(fā)生特異性反應(yīng)。臨床研究也表明HSP60抗體與冠狀動脈疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，是冠脈臨床事件發(fā)生主要危險原因。]ArteriosclerThrombVascBiol.;22:1547-1559.

RoleofHeatShockProteinsinAtherosclerosis-8-1520動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第20頁微生物HSP65/60和人HSP60抗體之間存在交叉反應(yīng)，抗微生物HSP65/60抗體能夠引發(fā)本身免疫反應(yīng)。除了廣泛關(guān)注肺炎衣原體和巨細(xì)胞病毒編碼HSP60與人HSP60分子模擬作用。除上述交叉反應(yīng)引發(fā)免疫反應(yīng)外，HSP可被TLR4識別經(jīng)過天然免疫在AS發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ArteriosclerThrombVascBiol.;22:1547-1559.

RoleofHeatShockProteinsinAtherosclerosis-8-1521動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第21頁4.β2糖蛋白I

β2糖蛋白Ⅰ是一個含326個氨基酸血漿蛋白，主要合成部位在肝臟，普通以游離形式存在于血漿，少許與脂質(zhì)結(jié)合。β2GpI是抗磷脂綜合癥（APS）主要抗原。各種炎癥性疾病，包含AS、狼瘡、APS血漿中都能檢測到抗β2GpI抗體，人AS斑塊內(nèi)也檢測到β2GPI。

DOMAINSTRUCTUREOFβ2-GLYCOPROTEINI-8-1522動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第22頁George用人β2GpI免疫LDLR-/-鼠，抗β2GpI抗體顯著增高，血管內(nèi)皮下較多CD4+T細(xì)胞浸潤，AS斑塊形成顯著加緊。用β2GpI免疫apoE-/-鼠也一樣顯示斑塊形成速度加緊，抗β2GpI抗體水平增高。Circulation.1998;98:1108-1115.

InductionofEarlyAtherosclerosisinLDL-Receptor–DeficientMiceImmunizedWithb2-GlycoproteinI-8-1523動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第23頁用β2GpI免疫普通小鼠，再將其淋巴結(jié)和脾臟處淋巴細(xì)胞注入LDLR-/-小鼠腹腔，發(fā)覺LDLR-/-小鼠早期AS斑塊增加。說明β2GpI經(jīng)過淋巴細(xì)胞在動脈粥樣硬化形成中發(fā)揮作用。Circulation.;102:1822-1827.

AdoptiveTransferofb2-GlycoproteinI–ReactiveLymphocytesEnhancesEarlyAtherosclerosisinLDLReceptor–DeficientMice-8-1524動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第24頁四、AS與天然免疫天然免疫是機體第一道防線，它經(jīng)過天然免疫效應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)分子發(fā)揮作用。天然免疫效應(yīng)細(xì)胞包含單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B1細(xì)胞等；天然免疫效應(yīng)分子則有炎癥介質(zhì)、補體等。單核/巨噬細(xì)胞在AS發(fā)病中含有主要地位，其它效應(yīng)細(xì)胞一樣可能發(fā)揮一定作用。-8-1525動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第25頁Kristina用半定量PCR和免疫組化方法發(fā)覺，人AS斑塊中TLR1、TLR2、TLR4表示顯著增加，同時也伴隨有NF-κB表示。推測TLRs在斑塊炎癥活化過程中天然免疫機制發(fā)揮作用。Circulation.;105:1158-1161.

ExpressionofToll-LikeReceptorsinHumanAtheroscleroticLesions:APossiblePathwayforPlaqueActivation

-8-1526動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第26頁

TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

TLR和PAPMs結(jié)合后形成二聚體,隨即轉(zhuǎn)接蛋白MyD88經(jīng)過C末端Toll/IL-1R（TIR）結(jié)構(gòu)域與TLR胞內(nèi)段相互作用，介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)單核細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活化，激活細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)共刺激信號B7分子表示，進(jìn)而經(jīng)過APC而活化Ｔ細(xì)胞。TLR細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子MyD88參加AS進(jìn)程。MyD88缺乏可使斑塊面積縮小，脂質(zhì)成份降低，促炎介質(zhì)以及細(xì)胞因子和趨化因子如IL-12和MCP-1表示降低。-8-1527動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第27頁Frank分別以野生型牙齦卟啉單胞菌和毒性減弱牙齦卟啉單胞菌菌毛缺失突變體(FimA-)感染apoE-/-小鼠。感染野生型牙齦卟啉單胞菌apoE-/-小鼠AS斑塊增加，主動脈壁TLR2和TLR4表示上調(diào)；而后者盡管在apoE-/-小鼠血液和主動脈弓組織內(nèi)檢測到FimA-突變株存在，不過沒有出現(xiàn)TLRs表示上調(diào)，斑塊病變無顯著進(jìn)展；提醒由TLRs介導(dǎo)天然免疫在AS發(fā)展中發(fā)揮主要作用。Circulation.;109:2801-2806.)InnateImmuneRecognitionofInvasiveBacteriaAcceleratesAtherosclerosisinApolipoproteinE–DeficientMice-8-1528動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第28頁清道夫受體巨噬細(xì)胞清道夫受體在生物學(xué)方面最新進(jìn)展是發(fā)覺，它既能識別感染性非本身物質(zhì)（病原體），又能識別修飾后本身物質(zhì)(凋亡樣細(xì)胞和修飾后LDL)，是模式識別受體家族中一員。

AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表示大量清道夫受體。尤其是SR-A，在天然免疫，凋亡樣細(xì)胞去除，以及組織自穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著主要作用。-8-1529動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第29頁SR-A1轉(zhuǎn)基因鼠

轉(zhuǎn)SR-A1C57BL/6小鼠喂養(yǎng)高脂飼料24周后，主動脈瓣膜附著處血管壁增厚，顯著粘液樣變性，冠脈內(nèi)膜增厚，泡沫細(xì)胞聚集、中膜粘液樣變性；主動脈蘇丹Ⅳ染色表明有顯著脂紋形成。-8-1530動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第30頁ControlgrouptransgenicgroupTransgenichighcholesterolgroupHighcholesterolgroup-8-1531動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第31頁小鼠主動脈粥樣硬化斑塊

-8-1532動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第32頁SR-AⅠ對ox-LDL誘導(dǎo)TPH-1細(xì)胞MMP-9表示影響

明膠酶譜MMP-9活性1：對照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-AⅠ正義寡核苷酸4：OX-LDL+SR-AⅠ反義寡核苷酸5：OX-LDL+SR-AⅠ抗體12354-8-1533動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第33頁SR-AⅠ對ox-LDL誘導(dǎo)TPH-1細(xì)胞MMP-2活性影響-8-1534動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第34頁SR-Ⅰ對ox-LDL誘導(dǎo)TPH-1細(xì)胞TIMP-1表示影響

TIMP-1WesternBlot

1：對照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-AⅠ正義寡核苷酸4：OX-LDL+SR-AⅠ反義寡核苷酸5：OX-LDL+SR-AⅠ抗體12345-8-1535動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第35頁肥大細(xì)胞肥大細(xì)胞表示Fcγ-RⅠ，F(xiàn)cγ-RⅢ，TLR-2，TLR-4，作為微環(huán)境感應(yīng)細(xì)胞在天然免疫和取得性免疫都起直接作用。外源凝集素、補體活化產(chǎn)物C5a、C3a等各種刺激物均可經(jīng)過Fcγ-Ⅰ激活肥大細(xì)胞。促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒。活化肥大細(xì)胞脫顆粒釋放大量生物活性物質(zhì)，包含血管活性物質(zhì)、中性蛋白酶、炎癥因子和生長因子等，促進(jìn)AS病變形成和破裂。-8-1536動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第36頁Circulation.1996;94:2787-2792.)MastCellsinRupture-ProneAreasofHumanCoronaryAtheromasProduceandStoreTNF-α-8-1537動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第37頁

對照組ox-LDL(48h)透射電鏡甲苯胺藍(lán)

染色-8-1538動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第38頁對照組試驗組主動脈病變HE染色試驗組主動脈甲苯胺藍(lán)染色Compound48/80對apoE基因敲除鼠主動脈斑快影響-8-1539動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第39頁即使NK細(xì)胞存在于斑塊處直接證據(jù)極少，但最近報道NK細(xì)胞功效抑制時，LDLR-/-小鼠體內(nèi)AS病變降低，NK細(xì)胞可能有致AS作用。

ArteriosclerThrombVascBiol.;24:1049-1054.DepletionofNaturalKillerCellFunctionDecreasesAtherosclerosisinLow-DensityLipoproteinReceptorNullMice-8-1540動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第40頁五、AS與抗原呈遞細(xì)胞

APC在連接天然免疫和取得性免疫中起橋梁作用，它能攝取、加工、處理抗原并將抗原信息呈遞給淋巴細(xì)胞，促使特異性淋巴細(xì)胞活化，產(chǎn)生取得性免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞是專職抗原呈遞細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮及間皮細(xì)胞等抗原呈遞作用較弱，為非專職性抗原呈遞細(xì)胞。

-8-1541動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第41頁

取得性免疫應(yīng)答需要雙信號開啟，即特異性抗原刺激和來自抗原遞呈細(xì)胞共刺激信號，這些信號多要APC尤其走DC提供。APC經(jīng)過其PRR模式識別作用內(nèi)在化病原體，并將其加工成MHC：肽復(fù)合物，之后遞呈給Th細(xì)胞，而且只有在將某一物質(zhì)識別為有害物后才表示共刺激信號Ｂ7分子。

-8-1542動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第42頁人和鼠AS斑塊均可檢測到DC，而且DC與T淋巴細(xì)胞同時存在于易破裂斑塊肩部。DC還可能經(jīng)過抗原呈遞作用刺激T淋巴細(xì)胞活化，影響斑塊穩(wěn)定性。DC在攝取微環(huán)境中抗原后深入分化成熟，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，激活取得性免疫反應(yīng)。JPathol.Dec;198(4):511-6.HumanatheroscleroticplaquesexpressDC-SIGN,anovelproteinfoundondendriticcellsandmacrophages.-8-1543動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第43頁六、AS與取得性免疫-8-1544動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第44頁Zhou等將apoE-/-鼠與scid/scid免疫缺點小鼠雜交其后代小鼠大動脈斑塊面積與apoE-/-鼠相比降低73％，而將apoE-/-鼠CD4＋T細(xì)胞移植到apoE-/-/scid/scid小鼠體內(nèi)，斑塊增加164％。

Circulation.;102:2919-2922.TransferofCD41TCellsAggravatesAtherosclerosisinImmunodeficientApolipoproteinEKnockoutMice-8-1545動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第45頁七、AS臨床事件與免疫反應(yīng)

免疫細(xì)胞在斑塊部位聚集，提醒免疫在AS發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起作用。Yuri發(fā)覺，NKT細(xì)胞和DC在AS斑塊肩部聚集，CD1+NKT細(xì)胞參加AS斑塊破裂，推測NKT細(xì)胞和DC間存在直接聯(lián)絡(luò)，共同參加AS斑塊破裂過程。JHistochemCytochem.Jun;53(6):781-5.Co-accumulationofdendriticcellsandnaturalkillerTcellswithinrupture-proneregionsinhumanatheroscleroticplaques.-8-1546動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第46頁而INF-γ抑制膠原合成，抑制SMCs增殖，還能夠與TNF-α和IL-1一起促進(jìn)SMCs凋亡，使纖維帽變薄，易于破裂。免疫介質(zhì)可經(jīng)過調(diào)整基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶和肥大細(xì)胞蛋白水解酶可降解纖維帽膠原釋放影響斑塊穩(wěn)定。

-8-1547動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第47頁人AS晚期病變中T細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)10％到20％，同時表示CD3、CD4和T細(xì)胞抗原受體（TCRαβ+）T細(xì)胞占全部CD3+T細(xì)胞百分比高達(dá)2/3（在apoE-/-鼠中可超出90％）。AS大部分臨床并發(fā)癥都包括血栓形成，T細(xì)胞在AS斑塊破裂處聚集可引發(fā)致命性動脈粥樣血栓形成。先天性免疫介質(zhì)可影響血栓形成一些步驟，組織因子（TF）是動脈粥樣血栓形成主要因子，LPS、TNF-α、IL-1、INF-γ和PTX-3都可誘導(dǎo)人ECs表示TF，CD40L可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞表示TF。-8-1548動脈粥樣硬化免疫機制的研究進(jìn)展第48頁而在動脈粥樣瘤內(nèi)Mφ、Ecs、SMCs和活化血小板都能夠表示CD40L[42]。可溶性細(xì)胞因子如