加強微生物監測、提升抗感染治療水平安徽省細菌耐藥監控中心安徽醫科大學臨床檢驗診療學教研室安徽醫科大學第一從屬醫院檢驗科徐元宏加強微生物監測提高抗感染治療水平第1頁一、正確留取標本是取得準確結果前提1.血液、骨髓、無菌體液：（1）嚴格消毒、防止體表正常菌群污染。（2）應在抗生素使用之前抽血。假如病人已使用抗生素，應選擇含中和劑（活性炭、中性樹脂）培養瓶，或在下次用藥前采血。（3）因為血液、骨髓、無菌體液含有極少許病原體，就能夠造成感染性疾病，而試驗室檢出率與病原體數量相關，并非只要有病原體就能檢驗出來，所以血液、骨髓、無菌體液等必須增菌才能取得滿意結果。成人未使用抗生素治療采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水、關節液3-10毫升接種成人培養瓶（藍蓋）；成人已使用抗生素治療采集上述標本接種加中性樹脂培養瓶（灰蓋）；兒童采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水，關節液1-3毫升接種兒童培養瓶（紅蓋）；厭氧培養接種上述標本3-10毫升于厭氧培養瓶（黃蓋）。（4）因為菌血癥、敗血癥是間歇排菌，應在發燒高峰時采血，對于感染性心內膜炎患者增加采血次數，以提升陽性率。加強微生物監測提高抗感染治療水平第2頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第3頁2.導管相關性血流感染（CRBSI）血培養（1）第一采集方法經外周靜脈穿刺采血》1套（送兩個培養瓶）；從導管中心或靜脈留置口隔膜采血1套，二者采血時間應該靠近（《5分鐘）。加強微生物監測提高抗感染治療水平第4頁結果解釋：（a）依據細菌判定和藥敏試驗確認，若兩套陽性血培養是同一個細菌，又沒有其它部位感染，提醒CRBSI；（b）若兩套陽性血培養瓶是同一個細菌，從導管采血血培養匯報陽性時間比外周靜脈穿刺采血早》120分鐘，又沒有其它部位感染，提醒CRBSI；加強微生物監測提高抗感染治療水平第5頁（c)依據細菌判定和藥敏試驗確認，若兩套陽性血培養是同一個細菌，又沒有其它部位感染，從導管采血血培養匯報陽性時間比外周靜脈穿刺采血不足120分鐘，提醒CRBSI；（d）若外周靜脈穿刺采血血培養是陰性，只有導管采血血培養是陽性，不能定為CRBSI；加強微生物監測提高抗感染治療水平第6頁（e）若只有外周靜脈穿刺采血血培養是陽性，但分離菌為金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位感染證據，提醒高度可疑為CRBSI；（f）若再次導管采血/外周采血，若培養陽性，且是同一個細菌，可定為CRBSI；加強微生物監測提高抗感染治療水平第7頁（2）第二種采集方法：外周靜脈穿刺采血采集1～2套，同時拔出導管，用Maki導管平皿滾動法，對導管尖片段進行半定量培養。加強微生物監測提高抗感染治療水平第8頁結果解釋：（a）假如兩套外周靜脈穿刺采血培養是陽性，導管片段培養為陽性（》15CFU/平皿），提醒為CRBSI；（b）假如兩套外周靜脈穿刺采血培養是陰性，導管片段培養為陽性，提醒可能為導管上定植菌，不支持CRBSI；加強微生物監測提高抗感染治療水平第9頁（c）若全部血培養和導管片段培養是陰性，不太可能是CRBSI；（d）假如有》1套血培養是陽性，導管片段培養是陰性，但分離株是金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位感染證據，提醒仍有可能是CRBSI。加強微生物監測提高抗感染治療水平第10頁3.尿液：（1）導尿法：是一個很好無菌采集法，主要適合用于手術后患者，取10-15毫升尿液于無菌容器內送檢，但留置導尿管易造成醫院內感染。（2）中段尿采集法：是臨床上最多采取方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗外陰及陰道口；男性病人應翻轉包皮沖洗，用1：1000新潔爾滅消毒尿道口，在用無菌紗布擦干，讓病人排尿，棄去前段尿，搜集中段尿10—20ml，盛于無菌容器內，馬上加蓋送檢。加強微生物監測提高抗感染治療水平第11頁（3）腎盂尿采集法：為確定菌尿是否來自腎臟，可用導尿管采集腎盂尿。首先充分沖洗膀胱，以最終一次沖洗尿作對照，后用導尿管插入輸尿管，分別標識左右側，搜集3次尿；假如輸尿管菌數比對照尿菌數多或第3次尿中菌數比第1次多，該菌尿可能來自腎臟。反之，假如第1次尿菌數多于第3次尿菌數，則可能來自膀胱。腎盂尿采集法普通應該請泌尿科醫師幫助進行，并確實做好標識，以防左右側搞錯。加強微生物監測提高抗感染治療水平第12頁（4）膀胱穿刺尿采集法：將病人恥骨上皮膚碘酒、酒精消毒后，以無菌針筒作膀胱穿刺。此法主要用于尿液中厭氧菌培養，故在取得尿液后，針頭插于橡皮塞上送檢。當兒童或嬰兒采集中段尿困難或培養結果與患者病情有矛盾時，可考慮用此法采集尿液。（5）留尿法：尿液檢驗結核分枝桿菌時，可用一潔凈容器，留取24h尿液，取其沉淀部分200-250毫升盛于清潔瓶內送檢。試驗室人員接收后應全部離心，涂片鏡檢。加強微生物監測提高抗感染治療水平第13頁4.痰液：正常人下呼吸道是無菌，上呼吸道有正常菌群借居。下呼吸道分泌物必須經過上呼吸道，常受上呼吸道正常菌群污染。所以對于下呼吸道分泌物培養出來結果必須分析、判斷。普通要求病人清晨用無菌生理鹽水漱口6次，再用冷開水漱口一次，用力咳深部痰液于無菌容器內送檢，防止口水污染。對于痰液不能自主咳出，可采取高滲鹽水霧化吸入排痰。

加強微生物監測提高抗感染治療水平第14頁試驗室在收到痰標本，涂片革蘭染色（SEC<10/LPF，WBC>25/LPF）可做細菌培養，統計涂片結果，SEC>25/LPF，WBC<10/LPF，視為污染，提議重留標本；介于二者之間做細菌培養，統計涂片結果，結合培養后細菌數量考慮是否是致病菌。合格痰標本用無菌生理鹽水約20毫升漂洗2次，用等量sputosol作用20分鐘。用接種環四區劃線，從一區到另一區應滅菌，接種直徑9厘米血平板兩塊，巧克力平板一塊，沙包氏培養基。加強微生物監測提高抗感染治療水平第15頁置CO2環境下培養。從采集標本到接種應在2小時內完成。未發覺致病菌，再培養72小時。若懷疑結核感染找抗酸桿菌，應搜集二十四小時痰液于清潔玻璃容器內。若懷疑放線菌感染，應讓病人留取含有顆粒痰液，試驗室查到硫磺顆粒且弱抗酸，能夠考慮放線菌感染。若懷疑口腔正常菌群紊亂或口腔霉菌感染，能夠用無菌棉簽取咽峽部分泌物于無菌容器內送檢。加強微生物監測提高抗感染治療水平第16頁5.皮膚、創面：首先按常規消毒皮膚，然后用無菌注射器抽吸皮下病變部分，或用無菌棉簽取痂下膿性分泌物。6.生殖道分泌物：依據病人主述臨床癥狀，采取不一樣方式取材：若病人白帶呈淡黃色，稀水樣，考慮滴蟲感染，用無菌棉簽取陰道分泌物于1毫升生理鹽水內送檢，注意保溫，因為當前滴蟲檢驗主要看鞭毛擺動動力。若病人白帶呈“豆腐渣”樣，燒癢癥狀，用無菌棉簽取“豆腐渣”樣白帶送檢，選擇不一樣送檢方式和檢驗方法可取得不一樣檢驗結果，其方法有生理鹽水直接鏡檢、涂片加NaOH破壞上皮細胞鏡檢、革蘭染色鏡檢，普通認為革蘭染色鏡檢是較為理想方法。加強微生物監測提高抗感染治療水平第17頁對于口腔、陰道等部位因為采取染色方法提升酵母菌檢驗靈敏度，對于是定植還是致病，當前缺乏診療依據。若懷疑淋病患者，對于男性急性患者，用一支棉簽檫去尿道口膿液，輕輕擠壓尿道口，再用一支棉簽取其膿液；對于男性慢性患者或治療后復查患者，用一支棉簽伸入尿道口2-4厘米，停留數秒鐘，旋轉取出，因為尿道口借居是鱗狀上皮細胞，尿道2-4厘米借居是柱狀上皮細胞，這是淋球菌借居地方。對于女性患者，用溫水濕潤擴陰器，取陰道分泌物或宮頸分泌物，棉簽停留數秒鐘，讓棉簽充分吸附分泌物。從直腸取材時，應將棉簽插入肛門2.5厘米以上，碰到糞便，應換一個棉簽重取。檢驗淋球菌性咽炎時，應從扁桃體及扁桃體窩取材。加強微生物監測提高抗感染治療水平第18頁支原體檢驗：支原體是簡單原核細胞，沒有細胞壁，缺乏許多細胞器，直接鏡檢沒有意義，只有經過培養，取材顯得主要，采集標本時，男性患者可用尿道拭子或清晨中段尿培養，女性推薦陰道拭子。衣原體檢驗：采取尿道標本，最少在排尿1小時后采集，對于男性尿道取材，棉拭子應伸入尿道2-4厘米（因為衣原體寄生在粘膜柱狀上皮細胞，而不是寄生在復層鱗狀上皮細胞中），轉動拭子以取得細胞；對于女性尿道取材，先用一個拭子擦凈尿道口，再用棉拭子加強微生物監測提高抗感染治療水平第19頁（?。┥烊肽虻?厘米，輕輕轉動拭子取出，對于女性宮頸取材，用溫水濕潤擴陰器擴張陰道，先用一個拭子擦凈宮頸口，然后再用棉拭子（小）伸入宮頸內1-2厘米，用力摩擦采取宮頸細胞，不采取膿液作培養。直腸取材，可將拭子插入肛門括約肌，在肛門和直腸結合處沿腸壁轉動，連續10-30秒，以吸收微生物，并防止糞便污染。尿液、精液、服過抗生素病人標本以及新近用過一些陰道制劑、清潔劑等病人標本不宜作衣原體檢驗。加強微生物監測提高抗感染治療水平第20頁二、正確檢驗病原體1.及時接種，選擇適當培養基：因為體外環境不是微生物生長最適宜環境，微生物怕冷、熱、光、干燥、消毒劑，所以試驗室接收標本后，應馬上接種；不一樣微生物需要不一樣營養要求和環境，選取不一樣培養基，制備不一樣環境，比如解脲支原體需要解脲支原體培養基，腦膜炎奈瑟氏菌需要營養豐富巧克力血平板和5-10%CO2，淋球菌需要Thayer-Martin（T-M）、NYC培養基和5-10%CO2。除此之外，為了更加好分離致病菌、抑制正常菌群和污染菌，需要加入一些營養因子和抑菌劑。比如淋球菌T-M培養加入血紅蛋白、萬古霉素、多粘菌素、制霉菌素、磺胺嘧啶。萬古霉素抑制葡萄球菌生長，多粘菌素抑制銅綠假單胞菌生長，制霉菌素抑制念珠菌生長，磺胺嘧啶抑制變形桿菌生長。有利一面，利于淋球菌識別；不利一面是遺漏可能致病菌，患者易產生繼發感染：繼發霉菌性陰道炎、淋病治愈后葡萄球菌性尿道炎。加強微生物監測提高抗感染治療水平第21頁2.怎樣將含量少病原體檢驗出來？及時接種，防止微生物死亡。一些感染必須增菌，以取得足夠數量病原體，血液、骨髓、胸水、腹水、腦脊液、關節液等必須接種到增菌培養基上。選取營養豐富培養基、提供適宜環境，滿足不一樣病原體要求。采取靈敏方法檢測病原體。加強微生物監測提高抗感染治療水平第22頁3.怎樣從眾多正常菌群中區分致病菌？采取營養豐富培養基和適宜環境滿足致病菌生長。采取含抑制劑培養基篩選致病菌。如解脲支原體培養基除含小牛血清外，還含有青霉素；分離大腸埃希氏菌O157，H7所用培養基是山梨醇麥康凱培養基。利用豐富、扎實知識識別致病菌。對于痰液：致病菌是腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、奴卡菌；可能致病菌是念珠菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌（指除凝固酶陽性金黃色葡萄球菌之外全部凝固酶陰性葡萄球菌統稱，當前包含31個種，是一個習慣稱法）、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他粘膜炎奈瑟菌等。加強微生物監測提高抗感染治療水平第23頁普通不是致病菌是指草綠色鏈球菌。對于尿液：分離到兩種以下細菌，可能是病人借居細菌，若分離到三種或三種以上，可能是污染菌，提議病人重新留取標本。在匯報細菌同時，應匯報菌落計數，過去認為對于革蘭陰性桿菌≥105

CFU/ml有致病意義，革蘭陽性球菌≥104

CFU/ml有致病意義；現在認為只要病人有主述癥狀，菌落計數≥100CFU/ml就有致病意義。加強微生物監測提高抗感染治療水平第24頁4.正確認識菌體形態和菌落形態經過革蘭染色將細菌分為：革蘭陽性桿菌、革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌、革蘭陰性球菌。因為該法簡單、快速，廣泛用于微生物檢驗。在無菌部位出現對應細菌，幫助我們用藥，在有菌部位，幫助我們分析是否菌群紊亂。經過抗酸染色將細菌分為：抗酸桿菌和非抗酸桿菌，對于經過痰液排菌肺結核患者、皮膚麻風患者、結核性腦膜炎患者有較大幫助。加強微生物監測提高抗感染治療水平第25頁經過墨汁染色能夠直接判斷有沒有新型隱球菌感染。菌落特征有突起、凹陷、色澤、色素等表面特征：肺炎鏈球菌展現肚臍樣凹陷，沙雷氏菌出現紅色色素，銅綠假單胞菌有綠色、無色色素，有姜味氣味，可展現粘液型菌落、粗糙型菌落、光滑型菌落。加強微生物監測提高抗感染治療水平第26頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第27頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第28頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第29頁5.正確判別病原菌對于細菌而言，主要依據表型特征，菌體、菌落形態，溶血性、生化反應，血清凝集將細菌判定。革蘭陽性球菌中葡萄球菌主要依據凝固酶、新生霉素抑菌試驗、生化反應來判斷；腸球菌依據6.5%NaCL、膽汁七葉苷與葡萄球菌、鏈球菌判別，依據甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸、阿拉伯糖、棉子糖、動力、黃色素、蔗糖、丙酮酸鹽來判別屬內12個種；鏈球菌屬依據cAMP、DNA、桿菌肽、血清凝集來判別。加強微生物監測提高抗感染治療水平第30頁革蘭陰性球菌主要依據氧化酶、DNA酶、生化反應來判別，淋球菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖陽性、乳糖陰性、麥芽糖陰性、甘露糖陰性、蔗糖陰性；腦膜炎奈瑟氏菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖陽性、乳糖陰性、麥芽糖陽性、甘露糖陰性、蔗糖陰性。革蘭陽性桿菌主要依據菌體、菌落，特征性染色來判別，結核分枝桿菌抗酸染色陽性，白喉棒狀桿菌Albert染色出現異染顆粒，產單核李斯特菌溶血性和動力。革蘭陰性桿菌主要依據氧化酶、氧化-發酵（O-F）試驗來判斷。加強微生物監測提高抗感染治療水平第31頁氧化酶陰性、氧化-發酵（O-F）發酵腸桿菌科編碼補充生化反應判定到種。對于致病性大腸埃希菌、志賀菌、沙門菌還需血清學凝集。加強微生物監測提高抗感染治療水平第32頁氧化酶陰性、氧化-發酵（O-F）氧化非發酵菌編碼氧化酶陽性、氧化-發酵（O-F）氧化/-補充生化反應判定到種。氧化酶陽性、氧化-發酵（O-F）發酵弧菌科編碼補充生化反應、血清學凝集判定到種，如霍亂弧菌O1、O139等。對于真菌而言，主要依據菌體形態、菌落形態、色素，同化試驗、發酵試驗來判別至種屬。試驗室人員迷惑：因為上述細菌、真菌判定依靠表型特征，表型是受基因控制，同一基因型可能有不一樣種表型，同一表現型可能受不一樣基因型所控制。依據表現型判斷菌體能代表真正菌屬嗎？伴隨分子生物學發展，人們能任意改造表現型。我們能有所作為嗎？加強微生物監測提高抗感染治療水平第33頁三、恰如其分匯報藥敏結果藥敏試驗中藥敏紙片選?。号R床醫生經常反應，試驗室所匯報藥敏試驗結果，臨床根本或極少使用這類藥品，試驗室藥敏試驗中藥品是敏感，臨床使用無效。怎樣聯適用藥、合理用藥？試驗室人員應依據可能細菌種類、細菌菌屬，合理選取藥敏紙片，匯報檢驗結果。試驗室應依據美國FDA推薦臨床微生物試驗室苛養菌和非苛養菌分組藥品選取，它將藥品分為四組：A組，一級試驗并常規匯報抗生素；B組，一級有選擇匯報抗生素；C組，補充試驗，有選擇匯報抗生素；U組，用于泌尿道補充試驗藥品。加強微生物監測提高抗感染治療水平第34頁比如對于腸桿菌科細菌常規匯報抗生素有氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、慶大霉素；選擇匯報抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、頭孢孟多或頭孢尼西或頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢美唑、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢噻肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、環丙沙星或左氧氟沙星、亞胺培南或美羅培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑。加強微生物監測提高抗感染治療水平第35頁對于銅綠假單胞菌和不動桿菌常規匯報抗生素有頭孢他啶、慶大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，選擇匯報抗生素有阿米卡星、氨曲南、頭孢哌酮、頭孢吡肟、環丙沙星、亞胺培南或美羅培南、妥布霉素。對于葡萄球菌常規匯報抗生素有苯唑青霉素、青霉素，選擇匯報抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或紅霉素、克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、萬古霉素。加強微生物監測提高抗感染治療水平第36頁對于腸球菌常規匯報抗生素有青霉素/氨芐西林，選擇匯報抗生素有萬古霉素。對于嗜血桿菌常規匯報抗生素有氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇匯報抗生素有頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢呋辛鈉（針劑）、氯霉素、美羅培南。加強微生物監測提高抗感染治療水平第37頁對于肺炎鏈球菌常規匯報抗生素有紅霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇匯報抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四環素、萬古霉素。對于除肺炎鏈球菌以外其它鏈球菌常規匯報抗生素有紅霉素、青霉素、氨芐西林，選擇匯報抗生素有氯霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢吡肟或頭孢他啶或頭孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/達福普汀。加強微生物監測提高抗感染治療水平第38頁對于淋球菌常規匯報β-內酰胺酶結果，如β-內酰胺酶陽性提醒青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥，但淋球菌更多是染色體介導耐藥，需要做補充藥敏試驗，選擇匯報抗生素有頭孢克肟或頭孢噻肟或頭孢泊肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢呋辛、環丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大觀霉素、四環素。加強微生物監測提高抗感染治療水平第39頁遵照嚴格操作方法、施加質量控制：紙片擴散法（K-B））法、液體稀釋法必須遵照NCCLS（CLSI）要求，它對紙片厚度、藥品濃度、培養基、培養環境、孵育溫度、操作方法都有詳細要求。E-test必須按照其說明要求進行。利用豐富理論知識，提醒臨床用藥：對于腸道分離沙門菌和志賀菌屬，常規僅測試氨芐西林、一個喹諾酮類藥品和TMP/SMZ藥品，1、2代頭孢菌素盡管體外敏感，但臨床治療無效，試驗室不能做此藥敏試驗。對于腸道外分離株，沙門氏菌屬還一定要測試并匯報氯霉素和某一個三代頭孢菌素。加強微生物監測提高抗感染治療水平第40頁對于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐慶大霉素腸球菌、AmpC-β-內酰胺酶應有所選擇性匯報藥敏結果，有時體外藥敏結果是敏感也要匯報耐藥。加強微生物監測提高抗感染治療水平第41頁1.藥敏試驗種類和方法：（1）細菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法加強微生物監測提高抗感染治療水平第42頁（2）酵母樣真菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法淺部真菌當前尚沒有標準方法。加強微生物監測提高抗感染治療水平第43頁細菌藥敏試驗-紙片擴散法Kirby-BaueragardiskdiffusionPaperdiskcontainingantibioticisplacedonlawnofbacteria,thenincubatedovernight.DiameterofzoneofinhibitionisinverselyrelatedtoMIC(usedtoestablishinterpretivebreakpoints).Standardizedforcommonlyisolated,rapidlygrowingorganisms.加強微生物監測提高抗感染治療水平第44頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第45頁細菌藥敏試驗-液體稀釋法Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104

cfu4210.50.250.120mg/ml加強微生物監測提高抗感染治療水平第46頁細菌藥敏試驗-E-test法E-testStripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.加強微生物監測提高抗感染治療水平第47頁醫院內感染菌經常是一些耐藥菌，試驗室應對這些細菌耐藥表型進行檢測。腸桿菌科（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、變形桿菌）應作超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）、耐糖肽類抗生素腸球菌（VRE）。四、耐藥表型檢測加強微生物監測提高抗感染治療水平第48頁1、甲氧西林葡萄球菌檢測：MRSA(Methicillin-resistantStaphylococusaureus)、MRSCON（Methicillin-resistantcoagulatase-negativeStaphylococcalspecies）檢驗：加強微生物監測提高抗感染治療水平第49頁（1）．紙片擴散（K-B）法因為苯唑青霉素較甲氧西林青霉素穩定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素測定葡萄球菌。M-H瓊脂平板，直接菌落懸液法，苯唑青霉素紙片含量為1μg/片，35℃二十四小時孵育，抑菌圈直徑《10mm。NCCLS推薦耐甲氧西林葡萄球菌評判標準:采取頭孢西丁紙片（30μg）,孵育二十四小時,對于金黃色葡萄球菌抑菌圈≤21mm為MRSA，≥22mm為MSSA;對于凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈≤24mm為MRSCON，≥25mm為MSSCON.加強微生物監測提高抗感染治療水平第50頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第51頁(2).瓊脂稀釋法篩選試驗：苯唑青霉素耐藥培養基：含NaCLM-H瓊脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6μg/ml苯唑青霉素或10μg/ml甲氧西林接種：直接菌落懸液約0.5麥氏比濁管，用拭子浸潤菌懸液后，在平板表面點種或劃線。培養條件：35℃空氣培養時間：二十四小時，對于甲氧西林/苯唑青霉素耐藥凝固酶陰性葡萄球菌，孵育48小時后再檢測最可靠。結果：>1菌落=耐藥推薦質控菌：金黃色葡萄球菌ATCC29213—敏感，金黃色葡萄球菌ATCC43300-耐藥加強微生物監測提高抗感染治療水平第52頁當前治療方案：MRS輕度感染：利福平、SMZ-TMP、環丙沙星；嚴重感染：萬古霉素。對萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌稱之為VRSA（Vancomycin-risistantS.aureus）只能用鏈陽霉素治療。當前金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥尚不多見，國外學者將腸球菌耐萬古霉素基因轉移到金黃色葡萄球菌中已取得成功；日本、香港散在報道且僅萬古霉素低度耐藥（MIC8μg/ml），且國際上還未認可；6月美國從一40歲患有糖尿病、慢性腎臟衰竭患者導管中分離到對苯唑青霉素MIC>16μg/ml,對萬古霉素MIC>128μg/ml耐萬古霉素金黃色葡萄球菌，VRSA就在我們眼前。加強微生物監測提高抗感染治療水平第53頁2.腸球菌檢測：腸球菌是一個主要病原微生物，試驗室應做高耐慶大霉素腸球菌檢測。若高耐慶大霉素，則不能和作用細胞壁藥品（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）協同使用。有條件試驗室還應作VanA,VanB,VanC耐藥基因監測。治療標準：VanA：青霉素敏感（S），氨基糖苷類非高耐--青霉素+慶大霉素；青霉素耐藥（R），氨基糖苷類非高耐--青霉素/頭孢類+壁霉素+慶大霉素。VanB：氨基糖苷類非高耐株--壁霉素+慶大霉素。氨基糖苷類高耐株--壁霉素，新生霉素+氟喹諾酮類。多重耐藥腸球菌當前尚無有效治療方案。加強微生物監測提高抗感染治療水平第54頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第55頁（2）．腸球菌高水平氨基糖苷類耐藥和萬古霉素耐藥篩選試驗（瓊脂稀釋法）篩選試驗慶大霉素HLAR抗生素含量：500μg/ml接種：液體生長法或直接菌落法至0.5麥氏比濁管。瓊脂-10ul0.5麥氏比濁管懸液點種在瓊脂表面。孵育條件35℃空氣孵育時間二十四小時結果：瓊脂：>1菌落=耐藥；肉湯：任何生長=耐藥,耐藥-不能和作用細胞壁藥品協同（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素），敏感-能夠和敏感作用于細胞壁藥品協同（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）。質控菌株：糞腸球菌ATCC29212-敏感；糞腸球菌ATCC51299-耐藥加強微生物監測提高抗感染治療水平第56頁篩選試驗：

萬古霉素耐藥抗生素含量：6μg/ml接種：肉湯-推薦標準肉湯稀釋法。液體生長法或直接菌落法至0.5麥氏比濁管。1-10μl0.5麥氏比濁管懸液點種在瓊脂表面。孵育條件：35℃空氣孵育時間：二十四小時結果：

>1菌落=耐藥進行萬古霉素MIC測定和動力試驗產生色素來區分取得性耐藥（VanA,VanB）和那些對萬古霉素天然中水平耐藥（VanC）如敦雞腸球菌、鉛腸球菌和黃腸球菌，它們通常在萬古霉素篩選平板上生長。質控菌株：糞腸球菌ATCC29212-敏感；糞腸球菌ATCC51299-耐藥加強微生物監測提高抗感染治療水平第57頁3.超廣譜β–內酰胺酶檢測：超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯氏菌等革蘭氏陰性桿菌在抗生素選擇壓力下產生。它是質粒介導對第一、二、三頭孢菌素、氧亞氨基β-內酰胺抗生素耐藥，有時盡管體外試驗是敏感，是β-內酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突變而來。ESBLs編碼基因在質粒上，易在不一樣菌株間播散，表現為多重耐藥。當前將ESBLs分為TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特點是能被β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。

加強微生物監測提高抗感染治療水平第58頁(1)．紙片初篩：培養基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度:頭孢潑肟10μg或頭孢他啶30μg或頭孢噻肟30μg或頭孢曲松30μg（使用兩個以上紙片做篩選試驗可提升檢出靈敏度）接種：按標準紙片擴散法孵育條件：35℃大氣環境孵育時間：16-18小時結果：頭孢泊肟抑菌環≤22mm，頭孢他啶抑菌環≤22mm，氨曲南抑菌環≤27mm，頭孢噻肟抑菌環≤27mm，頭孢曲松抑菌環≤25mm，=可能產生ESBL。提議質控方法:大腸埃希菌ATCC25922（參考NCCLS抑菌標準）

肺炎克雷伯菌ATCC700603:頭孢潑肟抑菌環9-16mm,頭孢他啶抑菌環10-18mm,氨曲南抑菌環9-17mm,頭孢噻肟抑菌環17-25mm,頭孢曲松抑菌環16-24mm。加強微生物監測提高抗感染治療水平第59頁(2)紙片確證試驗：培養基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度：頭孢噻肟30μg、頭孢噻肟/棒酸30μg/10μg和頭孢他啶/棒酸30μg/10μg接種：按標準紙片擴散法孵育條件：35℃大氣環境孵育時間：16-18小時結果：混合棒酸藥品紙片抑菌圈直徑比無棒酸藥品紙片直徑大5mm以上=ESBL提議質控方法：大腸埃希菌ATCC25922單獨藥品和混合棒酸藥品兩種紙片抑菌環直徑相差小于2mm。肺炎克雷伯菌ATCC700603：頭孢他啶單獨藥品和混合棒酸藥品紙片抑菌環較頭孢他啶單獨藥品紙片抑菌環直徑增大5mm以上，頭孢噻肟單獨藥品和混合棒酸藥品紙片抑菌環較頭孢噻肟單獨藥品紙片抑菌環直徑增大3mm以上。加強微生物監測提高抗感染治療水平第60頁加強微生物監測提高抗感染治療水平第61頁(3)液體稀釋法初篩:培養基：CAMHB（調整好陽離子M-H肉湯）抗生素濃度：頭孢潑肟4μg/ml或頭孢他啶1μg/ml或氨曲南1μg/ml或頭孢噻肟1μg/ml或頭孢曲松1μg/ml（使用1種以上藥品做篩選試驗可提升檢出靈敏度）接種：按標準肉湯稀釋法要求進行孵育條件：35℃；空氣孵育時間：16-18小時結果判讀：生長=可疑有ESBLS產生（即頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢曲松MIC≥2μg/ml；頭孢潑肟MIC≥8μg/ml

）質控提議：大腸埃希氏菌ATCC25922不長肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，頭孢潑肟MIC≥8μg/ml加強微生物監測提高抗感染治療水平第62頁(4)液體稀釋法確證:

培養基: CAMHB藥品濃度: 頭孢他啶0.25-128μg/ml,頭孢他啶/克拉維酸0.25/4-128/4μ