原生質體培養與體細胞雜交

——原生質分離培養

主講人：姜放軍湖南生物機電職業技術學院植物組織培養技術工作任務原生質體的培養及活力鑒定任務3對向日葵下胚軸和子葉的原生質游離任務1原生質體融合及融合體的培養

任務4融合體的選擇及雜種細胞進行鑒定

任務5

對獲得的原生質體純化任務2原生質體存活率測定原生質體純化原生質體培養原生質體融合融合體培養原生質體分離融合體的選擇雜種細胞鑒定原生質體培養和體細胞雜交基本流程及常用方法實踐知識一、向日葵下胚軸和子葉的原生質體分離（酶解法）

（一）無菌苗培育

選取仔粒飽滿日葵種子去殼后,消毒將消毒的種子接種于不含任何激素的MS固體培養基上。置于暗處發芽,溫度為(26±1)℃。（二）酶液的配制

酶液Ⅰ組成：纖維素酶酶液Ⅱ組成：纖維素酶（三）原生質體分離(一步分離法)

取前面培育的無菌苗，用刀片切下下胚軸后撕去表皮，縱剖若干細條，再橫切成2～3mm小段放入酶液Ⅰ中。撕去葉片的小表皮，切成小塊放入酶液Ⅱ中。每10mL酶液中約放2g材料，在26℃下酶解3～4h，其間搖動幾次。

（四）向日葵下胚軸原生質體的純化（漂浮法）漂浮法：是指應用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質體漂浮于液體表面，來進行原生質體純化的方法。

向日葵下胚軸原生質體的純化具體方法步驟如下：

1.將酶解后的向日葵下胚軸原生質體用200目不繡鋼網過濾，除去未解離的組織，再用22%的蔗糖溶液沖洗網上殘渣（蔗糖溶液體積與酶液相等）。

2.濾液（即酶液和蔗糖液）裝入離心管，以600r/min離心3～6min。

3.待原生質體漂浮后吸去下面的液體及殘渣。4.加入17%蔗糖溶液6～8ml，混勻后離心（600r/min，5分鐘），吸去下面的液體及殘渣，重復一次。5.加入1～2ml0.16mol/LCaCl2?2H2O（加1%MES，pH=5.8），使原生質體的密度在2103g/ml條件下懸浮，以備后面進行原生質體培養和融合之用。

（五）向日葵子葉原生質體的純化（界面法）界面法：是指選用兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質體的密度，另一種溶液密度小于原生質體的密度，原生質體即介于兩種溶液之間，從而對原生質體進行純化的方法。

原生質體分離及純化

一、原生質體分離雙子葉外植體胚性細胞（一）材料來源多數植物分離原生質體的經典材料-----葉肉細胞。問題探究

禾本科植物：愈傷組織或懸浮細胞。供體材料的重要性

供體材料是影響原生質體培養能否成功的關鍵。理論上植物的各種器官、組織和細胞都可作為分離原生質體的供體材料，但目前常用葉片、分裂旺盛和再生能力強的愈傷組織及懸浮細胞系，尤其是胚性愈傷組織或胚性懸浮細胞系是最理想的原生質體分離材料。（二）分離方法機械分離法酶法分離法最初用的是機械分離的辦法，但是效率極低。英國科學家Cocking于1960年利用酶.降解去細胞壁的辦法從番茄根尖分離了大量的原生質體，成為現在廣泛使用的方法。首先對外植體進行預處理有兩種方法：低溫處理：外植體放在4℃下，黑暗中1-2天。等滲溶液處理：外植體放在等滲溶液中數小時。1、機械分離法優點：

（1）能排除酶的有害影響；

缺點：

（1）原生質體的產量低；

（2）方法繁瑣費力；

（3）液泡化程度低的細胞也不能采用,此方法局限性大步驟：使細胞質壁分離→切開細胞壁→獲得原生質體。（1）確定酶的種類纖維素酶類（Cellulase）果膠酶類（Pectolyase）半纖維素酶類（Hemicellulase）崩潰酶蝸牛酶2、酶法分離（Enzymaticisolation）

植物細胞膜和細胞壁的構成：細胞膜：脂類、蛋白質細胞壁：初生壁（纖維素、半纖維素、果膠、量結構蛋白）、次生壁（纖維素、半纖維素）兩個相鄰細胞的初生壁之間有胞間層。（2）酶液的配制酶的配比及濃度滲透壓穩定劑及pH（3）分離原生質體一步法：外植體放入酶液，真空泵抽引滲透處理、26℃搖床振蕩2-8小時方法有二：

葉肉原生質體分離提純兩步分離法一步分離法兩步法：果膠酶處理材料、游離出單細胞、纖維素酶處理單細胞、分離出原生質體優點：所獲得的原生質體均勻一致、質量好；缺點：操作復雜，已被淘汰。圖示一步法原生質體分離過程（以葉片為例）過濾、離心加果膠酶和纖維素酶原生質體純化與活力測定（一）原生質體純化方法三種離心沉淀法漂浮法界面法

純化原因：上述酶處理后的混合物含有：未消化組織、破碎細胞和原生質體。所以，必須對得到的混合液體進行純化，以得到純凈的原生質體。問題探究1、離心沉淀法

原理：應用原生質體的比重大于溶液，離心后原生質體沉于底部。步驟：第一步原生質體溶液用400目網篩過濾，除去未消化的組織細胞。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此2-3次。第四步用原生質體培養液洗1次，收集原生質體。沉降法的優點：純化收集方便，原生質體丟失少；目前被廣泛采用。缺點：原生質體純度不高。2、漂浮法原理：應用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網篩過濾。第二步：離心。第三步：吸去上清液，洗滌液重懸，離心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生質體，用培養液洗1次。漂浮法的優點：原生質體純度高。缺點：原生質體收率低。3、界面法(不連續梯度法)

原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質體的密度，另一種溶液小于原生質體的密度。25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液

步驟離心管中配制成不同的濃度梯度加入原生質體混合液離心5min，原生質體位于某一濃度梯度，用吸管收集液體培養基。懸浮洗滌原生質體2-3次將原生質體懸浮在液體培養基中備用優點：獲得的原生質體大小均勻一致，純度高；

缺點：操作繁瑣，原生質體收率低。（二）原生質體活力測定1、形態識別：形態上完整，呈圓形，含有飽滿的細胞質，顏色鮮艷的即為存活的原生質體。2、染色識別

1）0.1%酚番紅或Evans藍染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。

2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質體。影響原生質體培養的因素原生質體活力原生質體起始密度：過低過高均不利滲透壓穩定劑：常用甘露醇培養基成分培養條件：初期培養是暗培養植物種類

原生質體培養一、培養基pH滲透壓鈣鎂生長物質氮源碳源培養基

（1）碳源

葡糖糖是最佳碳源，蔗糖單獨使用效果較差，與葡萄糖配合使用效果較好。碳源的作用一是保持細胞滲透壓，另一方面是作為細胞分裂時的能源物質和組成原料。（2）氮源

適當濃度的谷氨酰胺有利于原生質體的的細胞再生、分裂、生長。NH4+濃度太高不利于原生質體的培養，有毒害作用，在馬鈴薯上已有研究證明。（3）生長物質

生長素和細胞分裂素是細胞分裂分化所需要的通常物質，原生質體培養也需要這些生長調劑。但不同植物對生長調節劑的濃度要求不同。（4）鈣鎂

研究指出在原生質體培養中增加Ca2+的濃度?？稍鰪娫|體的穩定性，提高原生質體的分裂能力率。明顯改變細胞內外的離子交換。（5）滲透壓

最常用的滲透調節劑是山梨醇和甘露醇，兩者常結合在一起配合使用?，F在很多人用葡萄糖代替糖醇。（6）pH及滅菌

一般pH為5.6-6.0之間，培養基偏酸不利于與原生質體的培養。（7）常用培養基：MS、B5、N6.2、養條件培養溫度25-27度，光照16h/d左右，靜置為主，但為了不使細胞集聚，最初幾天需要經常輕輕搖動，以助通氣。有些材料不需要光照，所以依材料而定培養條件。3、與同種材料的不同基因型二、培養方法培養方法液體淺層培養平板培養法雙層培養法飼養層培養法原生質體懸浮液1mm厚液體培養基2x105/ml1、液體淺層培養2、平板培養

原生質體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37

C左右）等體積混合成0.7%，培養于培養皿中。3、雙層培養法（固、液培養）

培養皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養基，在其上進行原生質體淺層培養。固體培養基4、飼養層培養方法一：X-射線殺死原生質體，與生活力正常的原生質體混合，加入0.7%瓊脂，制成混合液，培養于培養皿中。方法二：X-射線殺死原生質體，與0.7%瓊脂混合，在培養皿中鋪成平板，作為飼養層，再將生活力正常的原生質體與0.7%瓊脂混合，培養于飼養層上。4、飼養層培養1、細胞壁再生：原生質體培養后1-2天即可合成完整細胞壁，只有形成完整細胞壁的細胞才能進入細胞分裂。2、細胞分裂、愈傷組織或胚狀體形成3、植株再生途徑：（1）通過愈傷組織形成不定芽；該途徑占多數。（2）原生質體再生細胞直接形成胚狀體。植株再生問題探究第一次分裂第二次分裂第三次分裂