-PAGEIII-雞大腸桿菌滅活疫苗的研制實驗探究目錄96761緒論 187981.1研究背景 1218321.2研究目的與意義 1190391.3研究現狀 1272732相關概念界定 3207162.1雞大腸桿菌 3147352.2研制滅活疫苗的必要性 368972.2.1大腸桿菌是條件性病原體 363602.2.2表雞群易繼發感染大腸桿菌 374743材料和方法 4106003.1材料 4160363.2方法 4693.3疫苗佐劑的制備 5272883.4疫苗的研制 5175144實驗結果 6146574.1毒株的選擇 6117164.2疫苗的安全性檢驗 623914.3疫苗的最小劑量試驗 7298844.4無菌檢驗 7317174.5效力檢驗 7325925結果與討論 72954結論 916343參考文獻 10690致謝 12PAGE2–PAGE11–1緒論1.1研究背景近幾年來,隨著養雞業的發展,大腸桿菌的發病率越來越高,不同養雞場的血清型不盡相同,而且大腸桿菌病用藥治療時又極易產生抗藥性。飼養場、戶在雞群發病時,憑主觀想象、憑一時經驗用藥、加大用藥量等盲目用藥、濫用藥,往往達不到治療效果,既增加了飼養成本,又延誤了治療時機。對于出口企業來說,難以控制藥物殘留,降低產品品質,影響出口創匯。也給養雞業造成很大損失。研制不同血清型的大腸桿菌油乳劑滅活疫苗迫在眉睫,并在此基礎上制定科學的免疫程序,從而達到預防該病的效果。1.2研究目的與意義雞大腸桿菌病是由致病性雞大腸桿菌引起的一種最常見近傳染病,也是危害養雞生產最嚴重的一種傳染病,其感染率幾近100%,致死率在15%以上。此病在不同季節、不同日齡均可發生,易與其他病混合感染,誘發了其他疾病的發生,增加了用藥成本,降低了飼料報酬,同時降低了家禽產品的品質,造成重大經濟損失。據我國學者介紹雞致病性大腸桿菌具有70多個血清型,各血清型之間交叉保護率極低,各地方血清型種類且差異大,為該病的防治帶來極大的困難。大腸桿菌病,往往會由來自場內的一個或數個血清型的致病性大腸桿菌所引起。為有效地控制本病的發生,本論文進行了雞大腸桿菌滅活疫苗的研制實驗，希望能為雞大腸桿菌的治療貢獻微薄之力。1.3研究現狀滅活疫苗指的是第一種病毒或細菌培養，然后用物理或化學方法殺死完整的致病微生物，殺死疫苗生產的滅活疫苗根據生產過程中使用的佐劑分為不溶性鋁膠體佐劑活疫苗，油乳液“滅活疫苗，蜂膠滅活疫苗。滅活疫苗開發周期短，使用安全，易于保存運輸，不易產生不良反應;但滅活的動物疫苗不能繁殖，往往需要接種疫苗才能產生保護性免疫，因而引起免疫反應通常是體液免疫，很少甚至沒有細胞接種滅活疫苗產生隨時間降低的抗體滴度，因此大多數滅活疫苗需要定期接種疫苗。目前，獸醫應用病毒疫苗是滅活幼苗和減毒幼苗。雖然對家畜禽類有一定的保護作用，但一些疫苗的效果并不理想。所以需要開發有效的新型疫苗。近年來，基因工程，蛋白質工程和免疫學的快速發展為新疫苗的開發提供了條件。目前有一些已獲得許可的疫苗;其他人仍處于試驗階段。最好的疫苗應該達到100％的保護，但這是不現實的。理想的疫苗應在免疫后數周內免疫，免疫力達90％以上。這不僅可以降低反復免疫的成本，而且可以顯著減少環境中的疾病數量。理想疫苗的另一個特點是成本會計低，這很重要。疫苗的使用應該是安全的，沒有任何副作用，免疫抑制和干擾同時免疫的其他疫苗。當使用多種疫苗時，疫苗的協調是疫苗設計者的關注點。另外，該疫苗在遺傳學和熱穩定性上都能通過。遺傳穩定，以防病毒回祖先成為病源，這是傳統減毒幼苗最大的缺點。從生產疫苗到最終使用過程中，不能總是保持冷藏，所以疫苗的熱穩定性決定疫苗效果的另一個標準。最后一點是，在家畜和家禽的情況下，應以被動方式進行免疫接種。不幸的是，目前沒有符合上述標準的疫苗，但隨著新方法的應用，疫苗的開發至少可以達到相當的標準。新的獸醫疫苗是免疫學和病毒學的熱點，包括亞單位疫苗，基因工程幼苗，重組病毒活載體疫苗和基因疫苗。已廣泛應用于研究和疾病預防與控制。最近的疫苗開發重點是基因疫苗。疫苗開發的重點是高效，安全，穩定，低成本。2相關概念界定2.1雞大腸桿菌雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌所引起雞全身性或局部性感染的一種疾病。雞大腸桿菌病在雞的育雛期、育成期和成年產蛋期均可發生，一般雛雞多呈急性敗血癥經過，而成年產蛋雞卻往往在開產階段發病，并導致產蛋雞的死淘率增高，嚴重地影響產蛋雞的產蛋生產性能；種雞場發生大腸桿菌病之后，不僅會影響到種雞的產蛋生產性能，而且還會直接影響到種蛋的孵化率、出雛率，從而會造成種蛋在孵化過程中的死胚率增高，孵出雛雞的健康水平降低。雞患大腸桿菌病雖然臨床癥狀表現得多種多樣，但多以引起敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、大腸桿菌性肉芽腫、臍炎等病變為主要發病特征，且在多數情況下常會因感染雞群受到各種應激因素的影響以及其他繼發感染和并發感染疾病的影響，則會導致感染雞群的發病癥狀表現得更加嚴重，從而更加增大了雞大腸桿菌病的控制難度。雞大腸桿菌病是由致病性大腸埃希氏桿菌引起的一種傳染病。該病的血清型較多，臨床表現復雜多樣。該病為條件性傳染病，多繼發或并發于其他疾病。根據大腸桿菌的菌體抗原(O)、表面原(K)和鞭毛抗原(H)的組合不同，可將本菌分為不同的血清型。迄今為止已知的血清型大約有數千種之多。2.2研制滅活疫苗的必要性2.2.1大腸桿菌是條件性病原體在大腸桿菌普遍存在于自然界和各種動物的胃腸道內，一般在雞群抵抗力正常的情況下是不易引起雞群致病的，而當雞群受到各種應激因素的刺激而使得機體的抵抗力降低時，則可引起雞群發病，如給雞群免疫接種疫苗、雞群的養殖密度過大、雞群轉群并舍、更換飼料、舍內寒冷潮濕和氣候突變等，這對雞群來說都是較大的應激刺激，均可能會降低雞群的抵抗力而引起大腸桿菌病感染，尤其是在育雛期或育成期，由于給雞群免疫注射疫苗、雞群轉群并舍、更換飼料等，對雞群均是比較強烈的應激刺激，很容易導致雞大腸桿菌病發生。2.2.2表雞群易繼發感染大腸桿菌當雞群發生其他疾病(如新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎、雞白痢、葡萄球菌病、球蟲病、傳染性法氏囊病、馬立克氏病等)之后，雞群的抵抗力降低，有的雞病(如傳染性法氏囊病、馬立克氏病等)還會對雞的免疫系統產生破壞，導致雞群出現不同程度的免疫抑制，從而為大腸桿菌的入侵打開了門戶，更容易導致雞群繼發感染大腸桿菌病。。3材料和方法3.1材料（1）菌種：雞敗血性大腸桿菌EC24、EC30、EC45、EC50、EC44等菌種。（2）實驗動物：1~4月齡健康雞。（3）主要器材：無菌室、無菌操作工作臺、恒溫培養箱、搖床、膠體磨、高壓流通蒸汽滅菌柜、干熱箱、顯微鏡、電子天平、燒杯、三角瓶、中性瓶、量筒、試管、平皿、吸管、注射器等。（4）試劑：蛋白胨營養瓊脂培養基、普通肉湯培養基、T.G小管、G.A斜面、G.P小管；甲醛溶液、10號白油、司盤-80、吐溫-80、硬脂酸鋁等。面。3.2方法（1）種毒的選擇：種毒的分離和培養，取場內多例典型的臨床病雞,無菌取心血、肝臟組織液劃線于普通營養瓊脂和麥康凱平板,置于37e恒溫培養18~24h,挑單個菌落與麥康凱平板純繁后行革蘭氏染色鏡檢和生化培養鑒定。（2）細菌的培養特性:在普通營養瓊脂種生長良好,菌落濕潤,灰白色、光滑,邊緣整齊,隆起。在麥康凱平板上,生長有粉紅色、光滑、邊緣整齊、不透明、直徑為1~1.5mm的菌落。在營養肉湯中生長良好,有絮狀沉淀。再經API生化鑒定。（3）動物回歸試驗:取細菌肉湯培養物,以0.1ml/羽的劑量肌注10日齡雛雞5羽,另設肌注生理鹽水對照組,剖檢死亡病雞,分離致病細菌。由蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏、蛋白粉、硫酸鹽、硫胺素、H2O組成122調pH為0.1。（4）大腸桿菌滅活疫苗的制備：大腸桿菌的增殖:將大腸桿菌E.y1和E.y2株分別劃線于麥康覬平板,37e培養18~24h,挑菌落于小瓶增菌液中,37e恒溫培養12h,再以1B50的比例擴大培養12h,期間每2h振搖1次,根據所需第三次擴大培養12~15h后終止培養,檢驗計數。增菌液的細菌純檢與計數:將培養液用細管稀釋法培養計數132,將細菌密度穩定在10ml上。在伊紅亞甲藍平板上生長的菌落呈紫黑色,并有金屬光澤。（5）增菌液毒力的檢驗:以0.1ml的劑量肌注5日齡雛雞5羽,隔離飼養觀察。32~48h內能全部致死,并具典型病變。（6）細菌的滅活:菌液中加入甲醛滅活,終濃度為4j,每隔3h振搖1次,置37e滅活24h,4e保存備用。3.3疫苗佐劑的制備（1）蜂膠佐劑:將蜂膠置15-24h,敲碎,高速粉碎過篩,1份蜂膠加4份95%分析純乙醇,25e溶解24h以上,4000r/min離心5min,取上清,4e保存備用152。（2）油相的制備:注射用白油94ml、司本-806ml、硬脂酸鋁2g的比例混合后,高壓滅菌10磅壓力(115e)30min,冷至室溫備用1.4.6蜂膠滅活疫苗的配制:將等量的E.y1和E.y2菌液,加4%吐溫-80,讓其充分溶解混合后,再加入適量配置好的蜂膠稀釋液,以8000r/min攪拌1min。分裝,4e保存備用。（3）油乳滅活苗的配制:如上同法配制水相,徐徐加入在油相中,以8000r/min攪拌3min,乳化而成。分裝,4e保存備用。（4）大腸桿菌菌液培養：將大腸桿菌菌種，分別接種于小管或小瓶普通肉湯培養基中，置36~37℃培養18~24h，經過純凈檢驗合格后作為種子液。將種子液接種于蛋白胨營養瓊脂培養基，置36~37℃培養18~24h。加適量無菌生理鹽水將細菌洗下，裝入滅菌的中性瓶中，充分震蕩菌液，使細菌分散開。將培養的細菌菌液接種于瓊脂培養基表面，置36~37℃培養18~24h。觀察菌落大小、顏色，應均勻一致。用麥氏比濁管法測定菌數，將菌數調整為15億個/ml。（5）乳化配苗：取注射用白油94份，加司盤-806份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。滅活菌液96份，取冷卻后滅菌的吐溫-804份，裝入帶玻璃珠滅菌的瓶中，充分振搖使吐溫-80完全溶解為止。取油相2份放于膠體磨或乳劑缸內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min攪拌2～5分鐘，在終止攪拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01％。乳化后，取3～5ml以3000r/min離心15分鐘，若有分層現象，應重復攪拌一次。3.4疫苗的研制將分離到的大腸桿菌在無菌條件下,接種于肉湯培養基內,于37℃恒溫箱中增殖,待增殖到預定菌數時取出,按終濃度3‰加入分析純甲醛溶液,置于37℃恒溫箱中滅活24h,每隔4h搖晃1次,然后取出,作無菌檢驗,確定無任何細菌生長后,密封,存放于4℃冰箱中備用。另取10號醫用白油加入定量硬脂酸鋁和適量的司盤80,高溫消毒后,作為生產疫苗的油相備用。再取檢驗合格的菌液,加入定量的吐溫80,作為生產疫苗的水相,按油相∶水相=1.5∶1混合后,經膠體磨乳化成大腸桿菌油乳劑滅活苗備用。蜂膠苗:黃褐色,色澤均勻,無沉淀。油乳苗:乳白色,均質,不分層。4實驗結果4.1毒株的選擇培養物經染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌,其主要生化特征見下表將兩株有生化特征差異的大腸桿菌E.y1和E.y2,進行回歸試驗表明:在24~48h內能全部致死試驗雞,剖檢觀察:具有典型的心包炎、肝周炎等病變,并可從心血、肝組織液中分離回大腸桿菌。4.2疫苗的安全性檢驗用1~4月齡健康雞4只，各皮下注射1rnl，注射后允許有輕微精神不振或食欲減退，但應在48h內恢復，均應健康活潑注射疫苗的雞群在觀察期內若由于疫苗注射而表現精神沉郁、食欲不振或下降、排黃綠色稀便、甚至死亡現象,其中出現任何一項均視為不合格。15d宰殺檢查注射部位,若腫脹、潰爛或有干物質存在,出現其中任何一項為不合格。取兩疫苗分別劃線于鮮血瓊脂斜面、普通營養瓊脂、麥康凱平板、營養肉湯37e培養72h,所有培養基均未見細菌生長。另以0.5ml/羽的劑量肌注10日齡雛雞10羽,隔離飼養觀察1周。疫苗的抗體消長情況觀察：（1）檢測方法的建立:根據大腸桿菌有凝集紅細胞的原理162,用綿羊紅細胞,經戎二醛固定鞣化后抗原致敏。以1%馬血清為稀釋液,在醫用微量反應板上進行間接血球凝集反應試驗172(按常規操作方法進行),在對照孔合格的前提下,以呈現/++0凝集的最大稀釋倍數為該份血清的最高抗體效價。（2）免疫抗體的檢測:以0.3ml/羽的劑量,取蜂膠苗和油乳苗免疫5日齡雛雞,兩者隔離飼養。免后5、10、15、20、30、40、50d,采血分離血清,用血凝試驗檢測免疫抗體。4.3疫苗的最小劑量試驗從同群雞中取試驗成雞40只,分成4組,其中1組作為對照,其余3組分別按0.5ml/只、1ml/只、1.5ml/只的劑量進行免疫。免疫20d后,用分離的大腸桿菌液按0.1ml/只腹腔注射,觀察7d,以出現精神沉郁、采食量下降,排黃綠色糞,甚至死亡現象均為不保護。試驗雞每只雞注射疫苗0.5ml,分別于免疫后60d、120d、180d進行攻毒試驗,攻毒方法及判定標準同上,測定疫苗的保護期。4.4無菌檢驗將成品1ml直接接種T.G培養基50ml，置37℃培養，3d后從小瓶中吸取培養物，分別接種T.G小管和G.A斜面各2支，每支0.2rnl。1支置37℃，1支置25℃；另取0.2ml接種1支G.P小管，25℃培養5d。應無菌生長。按菌液體積加入終濃度為0.3%的甲醛溶液，于37℃溫箱中滅活24h，期間震蕩數次。滅活后抽取少量菌液，接種于普通營養瓊脂平板，37℃培養24-~48h，進行滅活檢驗。菌液滅活后應無菌生長。4.5效力檢驗用3~6月齡健康易感雞8只，各頸部注射疫苗1rnl,3~周后，連同條件相同的對照組雞8只，各肌肉注射10個致死量強毒菌液1rnl，觀察14d，對照組雞全部死亡，免疫組雞至少保護6只為合格。5結果與討論雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種雞傳染性疾病。主要表現為膿毒癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、腹膜炎、大腸桿菌肉芽腫和全眼炎。目前，該病的預防和治療一方面由化學藥物控制，另一方面由疫苗接種。由于化學藥物的長期使用，導致了許多耐藥問題，耐藥菌株對動物和人類健康造成了嚴重危害。雞大腸桿菌病的發病率和死亡率都比較高,同時還能引發其它的并發或繼發癥,對養雞業的危害相當嚴重。由于大腸桿菌易產生耐藥性且耐藥質粒能夠遺傳,目前普遍存在抗生素濫用現象,因此藥物治療的療效不佳,研制大腸桿菌疫苗具有重要意義。由于導致雞大腸桿菌病的大腸桿菌致病性菌株的血清型較多,而且各地的分布不盡相同,其免疫原性又存在差異,所以在分離出細菌后還應該對它的免疫原性進行研究,所生產的疫苗在含有優勢血清型的同時,還要具有較好的免疫原性。另外,不同地區使用時應該考慮含有本地分離的主要流行株,從多個角度提高免疫效果。本試驗研制的雞大腸桿菌多價滅活疫苗含有標準菌株和多種地方分離菌株,并對菌種經過系統篩選,具有較好的免疫原性,在實際生產中能夠起到較好的免疫預防效果,在當前藥物防治效果不佳的情況下使用,不但能夠達到較好的預防目的,而且可以有效地節約藥費支出,降低生產成本,同時滅活疫苗的運輸、保存及使用都比較方便,因此該疫苗適合在生產中推廣應用。雞大腸桿菌自家滅活疫苗經實驗室和場內應用試驗證明,具有堅強的保護力,臨床應用效果顯著,操作簡便,使用安全,對降低使用化學藥物、改善生態環境、提高生產品質和經濟效益皆具一定的重要作用,有較好的實際應用價值。從臨床上對雞支原體(慢呼)病的診斷來看,幾乎都混合有大腸桿菌的感染,而大腸桿菌病的發生也較易引發慢呼病的發生,克制了這一方也就阻止了另一方的生長,因此筆者認為要做好慢呼的防控,需先做好大腸桿菌的防疫。雞大腸桿菌滅活疫苗制作工藝簡單,設備要求低,有利于實際應用。結論做好雞舍的衛生和消毒：大腸桿菌存在于自然界中，任何被大腸桿菌污染的東西都有可能成為傳播媒介，所以雞舍的環境衛生需要及時進行打掃消毒。飼料的選擇：選擇適合雞群的飼料，可在飼料中添加適量的維生素、抗生素以及微量元素?？股刂委煟喝绻挥写竽c桿菌感染，可以選擇恩諾沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、粘桿菌素、阿莫西林等藥物進行治療；如果是大腸桿菌與支原體混合感染可選用氟苯尼考、利福平和鎮喘寧這三種藥物一起進行治療；大腸桿菌和病毒混合感染時可以選用恩諾沙星和雙黃連口服液來治療。動物的大腸桿菌病經常在雞和雞中發生，大腸桿菌病的發生大多都與養殖的環境衛生程度有關，大腸桿菌可能感染養殖場中所有的東西，當動物接觸到被污染的物品或吃到被污染的飼料時就會被感染，剛出生的幼仔也有可能因為母親被感染在哺乳時被間接感染。目前對于大腸桿菌病的診斷主要是通過實驗室的細菌分離培養鑒定、觀察臨床癥狀、各種檢測技術。防治首要的是保證環境衛生，其次可以通過疫苗、抗生素、中藥進行治療?？股氐氖褂眯柚斏?，抗生素使用過多會破壞動物體內的正常菌群的平衡，也會增加菌株耐藥性。在最近的研究中，有研究人員提出了噬菌體療法，噬菌體可以有效防治大腸桿菌病。防治最重要的就是保護易感動物、切斷病原的傳播途徑。

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