關于微生物生長繁殖本章內容一、生物生長的測定1.以數量變化對微生物生長情況進行測定2.以生物量為指標測定微生物的生長二、

細菌的群體生長繁殖1.生長曲線2.同步培養3.連續培養三、

微生物生長繁殖的控制1.控制微生物生長的化學物質2.控制微生物生長的物理因素第2頁,共51頁，2024年2月25日，星期天要求：通過本章的課堂教學，使學生了解微生物生長繁殖的規律，掌握微生物生長的測定方法，及各種物理、化學因素對微生物生長的影響。

第3頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定（一）微生物生長概述（二）以數量變化對微生物生長情況進行測定（三）以生物量為指標測定微生物的生長要求：掌握微生物生長的常規測定方法（原理和操作）

第4頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定生長：個體體積的增加繁殖：個體生長到一定階段，通過特定方式產生新個體，即引起生命個體數量增加的生物學過程。在微生物學中提到的“生長”，一般均指群體生長，這一點與研究大生物時有所不同。細菌太小，往往討論其群體生長。（一）微生物生長概述第5頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定細菌個體生長包括細胞結構的復制和再生、細胞分裂和控制。（一）染色體復制和分離雙向復制復制附著點在CM上，隨CM生長和細胞分裂而分離，形成兩個子細胞。（一）微生物生長概述第6頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定（二）CW擴增桿菌中是新合成的肽聚糖在新舊Cw均有分布，而球菌是在赤道板插入，固定位置。（三）細菌分裂與調節各種物質復制后，質膜內陷伴隨新肽聚糖插入，導致橫隔壁向心生長，最后會合，一分為二。調節主要依賴轉肽酶和D，D－羧肽酶活性比。轉肽酶活性高些，利于CW擴增，導致細菌生長。羧肽酶高些，利于橫隔壁形成，導致細胞分裂。第7頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定第8頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定微生物生長的測定：個體計數：生物量測定：重量測定、生理指標測定（二）以數量變化對微生物生長情況進行測定通常用來測定細菌、酵母菌等單細胞微生物的生長情況或樣品中所含微生物個體的數量（細菌、孢子、酵母菌）第9頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定1、稀釋平板計數法對樣品進行適當稀釋→

單個微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長、繁殖→

肉眼可見的菌落→

對菌落數目的計數推測樣品中的微生物細胞數（二）以數量變化對微生物生長情況進行測定第10頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定2、涂布平板法使用較多的常規方法，但有時涂布不均勻?。ㄒ话?.2ml）（二）以數量變化對微生物生長情況進行測定同一稀釋度三個以上重復,取平均值；每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液；樣品充分混勻；每個平板上的菌落數目合適，便于準確計數；要求：每ml活菌數＝同一稀釋度平均數×稀釋倍數×5注意：要三個以上重復平板平均計數；不適合絲狀菌第11頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定3.顯微鏡直接計數法采用細菌計數板或血球計數板，顯微鏡下直接計數（計算一定容積里樣品中微生物的數量）。（二）以數量變化對微生物生長情況進行測定每ml原液含菌數＝每小格平均菌數×400×1000×稀釋倍數第12頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定顯微鏡直接計數法缺點：不能區分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；第13頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定（三）以生物量為指標測定微生物的生長1、比濁法在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。注意：測量應在菌濃度與O.D.成正比的線性范圍內，否則不準第14頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定2、重量法以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量；通過樣品中蛋白質、核酸含量的測定間接推算微生物群體的生物量；測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法（三）以生物量為指標測定微生物的生長第15頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、生物生長的測定3、生理指標法呼吸強度耗氧量酶活性與其群體的規模成正相關生物熱樣品中微生物數量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設備來測定相應的指標。（三）以生物量為指標測定微生物的生長第16頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖生長曲線：細菌接種到定量的液體培養基中，定時取樣測定細胞數量，以培養時間為橫座標，以菌數為縱座標作圖，得到的一條反映細菌在整個培養期間菌數變化規律的曲線。包括：遲緩期、對數期、穩定期、衰亡期1.遲緩期（lagphase）細胞分裂之前的準備，適應環境。將少量菌種接入新鮮培養基后，在開始一段時間內菌數不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。也稱延遲期、適應期。（一）生長規律第17頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一條典型的生長曲線至少可以分為

遲緩期，對數期，穩定期和衰亡期等四個生長時期第18頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖延緩期特點：細胞形態變大或增長，例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于遲緩期的細菌細胞體積最大；細胞內RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產生誘導酶。對外界不良條件反應敏感。（一）生長規律第19頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖減少遲緩期時間措施：（1）遺傳學方法改變種的遺傳特性（2）用對數生長期的做種子（3）接種前后培養基成分不要相差太大（4）適當擴大接種量（一）生長規律第20頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖2.對數生長期（logphase）這時的細菌代謝活性、酶活性穩定且高；大小一致；生活力強；用做種子和實驗材料。3.穩定期（stationaryphase）生長率為0，菌數最多并維持穩定，積累代謝產物的好時期。（一）生長規律第21頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖對數期到穩定期的轉變是細胞重要的分化調節階段：

1）開始儲存糖原等內含物；

2）形成芽孢或建立自然感受態（芽孢桿菌）

3）發酵過程積累代謝產物的重要階段；

某些放線菌抗生素的大量形成也在此時期（一）生長規律生產上延長穩定期的方法：補充營養物質（補料）或取走代謝產物；調節pH、調節溫度；對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩第22頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖4.衰亡期（deathphase）特點：細菌代謝活性降低；細菌衰老并出現自溶；產生或釋放出一些產物；如氨基酸、轉化酶、外肽酶或抗生素等。菌體細胞也呈現多種形態，有時產生畸形，細胞大小懸殊；有些革蘭氏染色反應陽性菌此時會變成陰性反應（一）生長規律第23頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖不同的微生物或同一種微生物對不同物質的利用能力是不同的。有的物質可直接被利用(例如葡萄糖或NH+4等)；有的需要經過一定的適應期后才能獲得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常稱為速效碳源（或氮源），后者稱為遲效碳源（或氮源）。當培養基中同時含有這兩類碳源（或氮源）時，微生物在生長過程中會形成二次生長現象。（一）生長規律第24頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間為代時(Generationtime)。代時通常以G表示。在群體生長里細菌數量增加一倍所需的時間稱為倍增時間（Doublingtime)。（二）生長數學模型dNdt＝μNN：每毫升培養液中細胞數μ：比生長速率，每單位數量細菌在單位時間增加的量t：培養時間

t1–t00.639G=——————=—————nm第25頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖使群體中不同步的轉變為同步生長或繁殖的方法。常用來科學研究和做種子。通過同步培養方法獲得的細胞被稱為同步細胞或同步培養物。分為：機械法

環境條件控制法

（三）同步培養第26頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖1、機械法根據不同階段細胞體積與質量或跟某種材料結合程度不同。（1）離心法（2）過慮分離法（3）硝酸纖維素膜法（三）同步培養第27頁,共51頁，2024年2月25日，星期天硝酸纖維素濾膜法是最經典的獲得同步生長的方法第28頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖2.環境條件控制法（1）溫度（2）培養基成分控制（3）其他，如：光（三）同步培養由于細胞的個體差異，同步生長往往只能維持2-3個世代，隨后又逐漸轉變為隨機生長。第29頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖采取一定措施使微生物以恒定比生長速率生長并持續。培養過程中不斷的補充營養物質和以同樣的速率移出培養物是實現微生物連續培養的基本原則。（四）連續培養dNdt=μN菌數增加速率dNdt=DN菌數減少速率第30頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖D：稀釋率，即培養基每小時流過培養容器的體積數μ>D，細菌數會增加，營養物消耗和代謝產物積累導致細菌停止生長。μ

＝D，維持平衡μ<D，菌被稀釋（四）連續培養第31頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖連續培養兩種類型：恒化器連續培養、恒濁器連續培養恒化：某種營養物質維持恒定恒濁：菌恒定（四）連續培養第32頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖恒濁器連續培養（四）連續培養測定所培養微生物的光密度值自動調節新鮮培養基流入和培養物流出培養室的流速使培養物維持在某一恒定濁度當培養室中的濁度超過預期數值時，流速加快，使濁度降低；當培養室中的濁度低于預期數值時，流速減慢，使濁度升高；第33頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖恒濁器連續培養連續發酵優點：缺點：（四）連續培養一般用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產物生產的發酵工業縮短發酵周期，提高設備利用率；便于自動控制；降低動力消耗及體力勞動強度；產品質量較穩定；雜菌污染和菌種退化第34頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、群體生長繁殖恒化器連續培養使培養液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率下進行生長繁殖。恒化連續培養中，必需將某種必需的營養物質控制在較低的濃度，作為限制性因子，而其他營養物均過量。限制性因子必須是機體生長所必需的營養物質，如aa和氨等氮源，或G、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，一定濃度范圍內決定細菌生長速率。（四）連續培養第35頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、環境對生長影響環境對生長影響1.營養物質2.水活性3.溫度影響：酶活性、CM流動性、物質溶解度4.pH5.氧第36頁,共51頁，2024年2月25日，星期天四、生長繁殖控制控制（有害）微生物的生長速率或消滅不需要的微生物，在實際應用中具有重要的意義。抑制：亞致死劑量因子作用使生長停止死亡：生長能力不可逆喪失防腐：理化因素防止或抑制微生物生長消毒：殺死或滅活所有病原微生物滅菌：殺死包括芽孢在內的所有菌化療：選擇毒性化學物質對生物體內部感染組織或細胞進行治療，對機體本身無毒害作用。第37頁,共51頁，2024年2月25日，星期天四、生長繁殖控制1.抗微生物劑（antimicrobialagent）殺死或抑制微生物生長的化學物質。分以下幾種：抑菌劑（bacteriostaticagent）：抑制生長不能殺死殺菌劑（bactericide）：殺死不裂解細胞溶菌劑（bacteriolysis）：誘導細胞裂解（一）控制微生物的化學物質第38頁,共51頁，2024年2月25日，星期天四、生長繁殖控制消毒劑：可殺死微生物，通常用于非生物材料的滅菌或消毒。防腐劑：能殺死微生物或抑制其生長，但對人及動物的體表組織無毒性或毒性低，可作為外用抗微生物藥物。抗微生物劑又叫殺菌劑，分消毒劑和防腐劑。第39頁,共51頁，2024年2月25日，星期天四、生長繁殖控制2.抗代謝物生長因子的結構類似物干擾達到抑制微生物生長目的。如：葉酸對抗物（磺胺）、

嘌呤對抗物（6-巰基嘌呤）、苯丙氨酸對抗物（對氟苯丙氨酸）、尿嘧啶對抗物（5-氟尿嘧啶）胸腺嘧啶對抗物（5-溴胸腺嘧啶）等等第40頁,共51頁，2024年2月25日，星期天四、生長繁殖控制3.抗生素（antibiotic）某些生物合成或半合成的次級代謝產物或衍生物，抑制或殺死其他微生物。主要通過：抑制CW合成、破壞CM、作用呼吸鏈、抑制Pr核酸合成。第41頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共51頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共51頁，2024年2月25日，星期天四、生長繁殖控制導致抗藥性菌株：細胞質膜透性改變：使抗生素不進入細胞或進入細胞后被細胞主動