慢病毒簡介專題知識講座慢病毒簡介專題知識講座第1頁2慢病毒載體概況HIV-1基因結構慢病毒載體歷史與構建重組慢病毒產生慢病毒在中樞神經系統中應用慢病毒在造血干細胞系統中應用慢病毒在眼科疾病治療中應用慢病毒簡介專題知識講座第2頁31.慢病毒載體概況慢病毒是逆轉錄病毒科亞科之一，分為靈長類和非靈長類慢病毒。靈長類慢病毒包含HIV-1，HIV-2，猴免疫缺點病毒（SIV），非靈長類慢病毒包含貓免疫缺點病毒（FIV），牛免疫缺點病毒（BIV），馬免疫缺點病毒（EIAV）等，其中HIV研究最為透徹。研究表明慢病毒核蛋白質前整合復合物含有噬核特征，病毒基因組運輸至細胞核，從而使慢病毒能夠感染和在非有絲分裂細胞中復制。這一特征是慢病毒成為基因治療轉移載體。慢病毒簡介專題知識講座第3頁42.HIV-1基因結構HIV-1為雙鏈RNA病毒，共有9個基因。

gag基因編碼病毒關鍵蛋白，包含基質蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白。pol基因編碼病毒復制所需酶，如反轉錄酶、整合酶、蛋白酶。env基因編碼病毒包膜糖蛋白，決定病毒感染宿主靶向性。rev編碼蛋白調整gag、pol、env表示水平。tat編碼蛋白參加RNA轉錄控制。4個輔助基因vif、vpr、vpu、nef編碼蛋白則作為毒力因子參加宿主細胞識別和感染。兩端為長末端重復序列(LTR)，內含復制所需順式作用元件。編碼病毒基礎結構調整基因慢病毒簡介專題知識講座第4頁53.慢病毒載體歷史與構建3.1第一代HIV-1起源慢病毒載體以Naldini及Kafri構建三質粒系統為代表，該系統由包裝質粒、包膜質粒及載體質粒3種質粒組成。包裝質粒是HIV-1前病毒基因組5’端LTR由巨細胞病毒早期開啟子取代，3’LTR由SV40polyA序列取代。包裝成份分別構建在兩個質粒上，一個表示gag和pol，另一個表示env。載體質粒攜帶了5’端LTR，和全部5’端非翻譯區域，另外還帶有rev應答元件（RRE）。包膜表示質粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來代替了原病毒env基因。

慢病毒簡介專題知識講座第5頁63.2第二代HIV-1起源慢病毒載體

1997年,Zufferey等將包裝質粒上vif、vpr、vpu和nef基因(即輔助基因)敲除,從而得到,其它方面與第一代載體系統一致。

慢病毒簡介專題知識講座第6頁73.3第三代HIV-1起源慢病毒載體為降低復制型病毒產生，可經過降低輔助質粒與載體質粒同源性，或者將gag/pol和rev編碼序列隔離,分散在不一樣質粒上。這么包裝系統由四質粒代替原有三質粒包裝系統。質粒一攜帶了gag/pol編碼序列及RRE;

質粒二包含了編碼rev序列;

質粒三是載體質粒;

質粒四表示env。慢病毒簡介專題知識講座第7頁83.4本身失活型（SIN）慢病毒載體

SIN載體構建是在原病毒載體基礎上刪除了病毒3’端LTRU3區增強子和開啟子序列片段。該區域出現突變則在HIV-1載體轉錄后，其5’LTR會因為缺失HIV-1所需要開啟子和增強子序列而無法復制出完整長度病毒基因組。慢病毒簡介專題知識講座第8頁94.重組慢病毒產生

常見瞬時轉染法，即將包膜質粒，包裝質粒和載體質粒共轉染人胚腎293T細胞直接產生生產細胞。最終慢病毒分泌到培養基中進行培養而得到大量載體慢病毒。慢病毒簡介專題知識講座第9頁10慢病毒在中樞神經系統中應用慢病毒簡介專題知識講座第10頁111.IntroductionRecombinantviralvectorshavebeenusedtostudyavarietyoffundamentalissuesindevelopmentalneurobiology,aswellaspathogenesisandtreatmentsforvariousneurodegenerativediseases.Lentiviralvectorsarevaluabletoolsforneurobiologyresearchowingtotheirabilitytotransducenondividingcells,suchasneurons,andtointroducetherapeuticorreportergenesintocentralnervoussystem(CNS)cellsinvivoandinvitro.

重組病毒載體已被用于研究各種發育神經生物學中基礎問題，以及各種神經退行性疾病發病機理和治療。慢病毒載體能轉導分裂細胞，如神經元，并介導中樞神經系統（CNS）細胞在體內和體外基因治療或報道基因而作為神經生物學研究有價值工具。慢病毒簡介專題知識講座第11頁121.1.LentiviralGeneDeliverytoCNSCellsLentiviruspreintegrationcomplexesinteractwiththenuclearporeandundergoactivetransportintothenucleusofnondividingcells,wheretheproviralDNAisintegratedintothegenomicDNAofthehostcell.Thisfeatureistheprimaryreasonwhylentivirusesarebeingdevel-opedasgene-transfervectorsforpostmitoticcellsintheCNS.

慢病毒整合前復合物與核孔相互作用進入細胞核分裂細胞，其中前病毒DNA整合到宿主細胞基因組DNA并進行主動運輸。此功效是為何慢病毒在有絲分裂后細胞在中樞神經系統基因轉移載體主要原因。慢病毒簡介專題知識講座第12頁13Self-inactivating(SIN)vectorsreducetheprobabilityofoncogenesisbypro-moterinsertion.InSINvectors,viralpromoteractivityisdeletedfromtheinte-gratedprovirusbydeletionsintheU3regionofthe3’longterminalrepeat(LTR)thatarecopiedduringreversetranscriptiontothe5’LTR.

本身失活型（SIN）慢病毒載體3’端LTRU3區開啟子發生失活突變后，在逆轉錄過程中轉移至5’LTR。這么載體整合入靶細胞，將不會產生完整長度載體RNA，所以命名為“本身失活型載體”。慢病毒簡介專題知識講座第13頁14Toincreasegenedeliveryinbrain,newergenerationsoflentiviralvectorsincorporatethecentralpoly-purinetract(cPPT),anapprox180bpregionderivedfromthegagregion,whichincreasesnuclearimportoftheproviralDNAandtransductionefficiencyinthebrain.

為了增加基因在腦中傳遞，新一代慢病毒載體包含cPPT，一個來自gag區約180

bp區域，從而增加了原病毒DNA進入核，也提升了在大腦中轉導效率。慢病毒簡介專題知識講座第14頁151.2.TargetedGeneDeliveryintheCNSUsingPseudotyped

LentiviralVectorsAnotherfeatureofthelentiviralvectorsystemisthatthevirionscancarryasurfaceproteinthatbypassestheusualHIVreceptorsandco-receptors,thuschangingorexpandingtherangeofcelltypesthatthevectorcanbindtoandenter.Thisisdonebypseudotyping,whichinvolvesreplacingtheHIV-1envelopeglycoproteinwithanenvelopeglycoproteinfromanothervirus,suchasthe

vesicularstomatitisvirusglycoprotein(VSV-G).

慢病毒載體系統另一個特征是攜帶病毒微粒表面蛋白，包含HIV受體和共受體，從而改變或擴充細胞類型范圍，使得該載體能夠結合而且進入。這個模型包括取代HIV-1包膜糖蛋白與另一個病毒包膜糖蛋白，如皰疹性口腔炎病毒糖蛋白（VSV-G）。慢病毒簡介專題知識講座第15頁161.3.LentiviralVectorProductionThedevelopmentofstablepackagingcelllinesthatproducehightitersoflentiviralvectorshasbeenhinderedbythetoxicityofconstitutiveVSV-Gexpression.Forthisreason,manygroupscontinuetousetransienttripletransfectiontogeneratetheirvectorstocks.

產生高滴度慢病毒載體穩定包裝細胞系發展受到VSV-G表示毒性妨礙。所以，大多數人使用三質粒系統。慢病毒簡介專題知識講座第16頁17Threeplasmidsarerequired:encodingtheenvelopeglycoprotein(mostcommonlyVSV-G),

encodingthepackagingproteins(minimallyincludinggagandpol,oftenincludingtatandrevonthesameplasmid,andinsomecasestheaccessorygenesvif,vpr,vpu,andnef),encodingthegenome(includingtheintactorself-inactivatingLTR’s,thepackagingsignal,thepromoterandcDNAofinterestand,insomecases,posttranslationalregulatoryelementsandthecentralpoly-purinetract(cPPT),whichincreasetiterandexpression.慢病毒簡介專題知識講座第17頁182.Materials

2.1.Transfection1.Ahighlytransfectablecelllinesuchashumanembryonickidney293T.2.Growthmediafor293Tcells.3.Poly-D-lysine.4.Boratebuffer.5.Reagentsforcalciumphosphatetransfection.慢病毒簡介專題知識講座第18頁196.High-qualityplasmidDNA:transferplasmid,packagingplasmid,envelopeplasmidpurifiedthroughcesiumchloride/ethidiumbromideequilibriumcentrifugationorananion-exchangematrix.7.Polybrene,800μg/mLstocksolutioninPBS.8.LargepolyallomercentrifugetubesforconcentratingthevectorinaBeckmanSW28ul-tracentrifugerotor.慢病毒簡介專題知識講座第19頁202.2.StereotacticSurgeryAnaesthesiamice.SurgicalPreparation.Drillingandinjection.Postoperativecare.Perfusion.AmanualforstereotaxicsurgerysuchasStereotaxicSurgeryintheRat.AmousebrainatlassuchasTheMouseBraininStereotaxicCoordinates.慢病毒簡介專題知識講座第20頁213.MethodsTransfection轉染CollectionandConcentrationoftheViralSupernatant

搜集和集中病毒上清TiteringLentiviralVectors

滴定慢病毒載體慢病毒簡介專題知識講座第21頁22慢病毒在造血干細胞系統中應用慢病毒簡介專題知識講座第22頁23造血干細胞（HSC）含有自我更新和分化為血液及免疫系統中各種成熟細胞能力，許多HSC疾病如遺傳性、代謝性和感染性疾病或惡性腫瘤等有望經過基因治療方法得到糾正。目標基因轉移HSC后，可伴隨HSC自我更新和分化在體內長久表示，所以HSC是較理想基因轉移靶細胞。慢病毒簡介專題知識講座第23頁24研究表明，VSV-G假構型HIV-I載體可不經過對HSC預刺激就能有效地將基因轉移到人早期干細胞并能在重度聯合免疫缺點(SCID)鼠骨髓中穩定地長久表示，Miyoshi等構建VSV-G假構型HIV-I載體，以綠色熒光蛋白（GFP）作為標識基因，將新鮮分離人臍血CD34+細胞在無血清及細胞因子培養基中轉染5小時，然后植入經亞致死量照射非肥胖型糖尿病/重度聯合免疫缺點(NOD/SCID)鼠，可在受鼠脾臟、骨髓及外周血GFP長久表示。慢病毒簡介專題知識講座第24頁25MethodsIsolationofHumanCD34+HematopoieticProgenitorCells

人CD34+造血祖細胞分離PreparationofLentiviralVectors

慢病毒載體制備TransductionofCD34+CellsbyLentiviralVectors

慢病毒載體轉導CD34+細胞AnalysisofTransducedHumanCD34+CellsinNOD/SCIDMice

分析轉人CD34+細胞NOD/SCID小鼠慢病毒簡介專題知識講座第25頁26慢病毒在眼科疾病治療中應用慢病毒簡介專題知識講座第26頁271.IntroductionTheprimaryaimofgenetransferintotheretinalcellshasbeentoinvestigatethedevelopmentalmechanismsoftheretinalcellsortoreverseretinaldiseases.Currently,lentivirusandadenoassociatedvirusvectorsarebeingusedforstudyingandcorrectinggenetherapyofretinaldegenerativediseases.

視網膜細胞基因轉導主要目標是研究視網膜細胞發病機制或逆轉視網膜疾病。

當前，慢病毒和腺病毒載體在被用于研究和糾正視網膜變性性疾病基因治療。慢病毒簡介專題知識講座第27頁28UsinganHIVvectorcarryingthegreenfluorescentprotein(GFP)geneexpressedfromthecytomegalovirus(CMV)p