單基因遺傳病的研究策略單基因遺傳病的研究策略第1頁假如一個遺傳病發病僅僅包括到一個基因，這個基因稱為主基因(majorgene)，其造成疾病稱為單基因病。單基因遺傳病單基因遺傳病的研究策略第2頁單基因遺傳病發病復雜性外顯率：一定基因型個體表現出疾病表型百分比表現度：相同基因型不一樣個體在疾病表現程度差異基因多效性：一個基因有各種生物學效應遺傳異質性：表型相同而基因型不一樣現象從性遺傳和限性遺傳：常染色體上基因在不一樣性別有不一樣表示程度和表示方式，從而造成男女性狀分布上差異遺傳早現現象：疾病在世代中存在發病年紀逐步提前或病情逐代加重情況單基因遺傳病的研究策略第3頁研究策略與方法臨床診療、家系調查與材料搜集侯選基因確實定已知致病基因突變位點確實定連鎖分析與未知基因基因定位基因型與表現型相關性研究發病機制研究單基因遺傳病的研究策略第4頁臨床診療、家系調查與材料搜集單基因遺傳病的研究策略第5頁臨床診療查閱相關資料，認識不一樣遺傳病患者臨床表現及其輔助診療辦法臨床診療：癥狀和體征常規輔助檢測指標特殊診療指標單基因遺傳病的研究策略第6頁家系調查與系譜分析調查家系三代以上全部相關組員信息依據調查資料，用系譜中常見符號繪制成系譜系譜分析：區分遺傳病與非遺傳病區分單基因與多基因病判斷遺傳方式單基因遺傳病的研究策略第7頁大家系單基因遺傳病的研究策略第8頁散發病例單基因遺傳病的研究策略第9頁臨床遺傳病家系特點散發病例：對于遺傳病，包含單基因遺傳病，多數病例表現為散發。小家系病例：在有家族史病例中，多數也是小家系。大家系病例：極少數家系發病個體多，包括3-4代都有患者。單基因遺傳病的研究策略第10頁搜集材料采集樣品：

外周血，頰粘膜脫落細胞，毛囊,

病人組織（如能夠取材），羊水（產前診療）采集家系應做到盡可能完整患者、同一家系中有相同遺傳背景表型正常其它個體、該家系中其它遺傳背景組員單基因遺傳病的研究策略第11頁搜集臨床資料病人臨床上一系列指標檢測保留相關信息和影象資料病人血清或組織保留及其酶、病理或免疫學研究單基因遺傳病的研究策略第12頁侯選基因確實定單基因遺傳病的研究策略第13頁文件檢索數據庫

中OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）數據庫中整合了當前已定位單基因病信息確定自己所研究家系可能已知候選基因或已定位染色體候選區域單基因遺傳病的研究策略第14頁依據疾病名稱檢索單基因遺傳病的研究策略第15頁依據基因檢索單基因遺傳病的研究策略第16頁檢索最新文件單基因遺傳病的研究策略第17頁確定已知致病基因突變單基因遺傳病的研究策略第18頁取得已知基因基因組序列設計引物或參考文件中引物依據文件，采取適當技術方法進行基因突變分析（在后面課程中詳細介紹）從數據庫中查閱目標基因相關信息單基因遺傳病的研究策略第19頁

PCR-測序分析MFN2基因結果發覺錯義突變:c.281

G>A,其所在密碼子由CGG變為CAG,造成其編碼氨基酸由精氨酸變為谷氨酰胺.結論：經查閱文件資料，c.281

G>A為已知致病突變位點，可判斷其為該患者致病突變位點。

單基因遺傳病的研究策略第20頁依據變異造成結果判斷依據突變數據庫和文件資料排除已知SNP依據家系共分離是否判斷在正常對照人群中分析保守性分析基因功效分析突變分析結果判斷單基因遺傳病的研究策略第21頁連鎖分析與未知基因基因定位單基因遺傳病的研究策略第22頁

利用被定位基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區帶上。連鎖分析注：適于分析較大遺傳病家系，不適于散發病例和小家系病例單基因遺傳病的研究策略第23頁連鎖

重組單基因遺傳病的研究策略第24頁遺傳標識進行連鎖分析時需要一些已知遺傳位點，這些位點應按孟德爾方式遺傳，且含有多態性方便顯示連鎖關系，這些標識位點稱為遺傳標識RFLP，STR,SNP單基因遺傳病的研究策略第25頁連鎖分析結果單基因遺傳病的研究策略第26頁連鎖分析結果單基因遺傳病的研究策略第27頁基因定位：將致病基因確定到染色體實際位置未知致病基因定位克隆研究基因克隆：確定致病基因單基因遺傳病的研究策略第28頁定位克隆基礎方法和步驟搜集家系，選擇遺傳標識進行連鎖分析，對目標基因作圖定位確定候選位置，對目標基因進行精細定位從候選基因中確定正確基因（二代測序技術）單基因遺傳病的研究策略第29頁例：一個X連鎖肌肉病家系致病基因定位克隆研究

單基因遺傳病的研究策略第30頁家系情況及前期研究基礎先證者Ⅲ2臨床表現近似DMD排除了DMD/EMD/FHL1基因突變單基因遺傳病的研究策略第31頁研究策略SNP芯片分析精細定位分析基因查閱外顯子組測序全基因組90萬個SNP位點；8例樣本；商業企業完成選取數個SNP點；增加3個組員連鎖區域內基因：MapViewer；基因表示：UniGene數據庫及HGNC網站；基因功效：OMIM數據庫1例樣本(I2)；商業企業完成單基因遺傳病的研究策略第32頁SNP芯片數據分析

連鎖分析

提醒X染色體有三段連鎖區域：單基因遺傳病的研究策略第33頁單體型分析單基因遺傳病的研究策略第34頁

GenemaplocusGRCh37.p5

PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)GeneticMap(Marshfield)(cM)

Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49

Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62

Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段連鎖區域單基因遺傳病的研究策略第35頁精細定位分析將Xp22.32-p22.2連鎖區域由6.78Mb縮短為4.18Mb

單基因遺傳病的研究策略第36頁排除Xp21.2-p21.1連鎖區域單基因遺傳病的研究策略第37頁必定Xq24-q27.2連鎖區域單基因遺傳病的研究策略第38頁最終確定兩段連鎖區域Genemap

locusGRCh37.p5

PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06

單基因遺傳病的研究策略第39頁連鎖區域內包含基因Xp22.32-p22.2連鎖區域共28個基因：14個已知基因,14個預測基因14個已知基因：6個基因在肌肉組織中表示（3個基因表型已知，均與肌肉病無關）7個基因不在肌肉組織表示1個基因表示情況未知

單基因遺傳病的研究策略第40頁Xq24-q27.2連鎖區域共272個基因：122個已知基因,150個未知基因122個已知基因：79個基因在肌肉組織中表示（18個基因表型已知，其中包含前期已經排除FHL1基因）41個基因不在肌肉組織表示2個基因表示情況不清楚

單基因遺傳病的研究策略第41頁外顯子組測序平均覆蓋度：23.8×；覆蓋度大于>20×位點占53.7%在上述兩個連鎖區域測序深度均很低對測序深度>20變異位點進行驗證，結果均無變異單基因遺傳病的研究策略第42頁存在問題及處理方法本家系患者未進行肌肉活檢將進行多個樣本外顯子組測序單基因遺傳病的研究策略第43頁Genotype和Phenotype相關性研究單基因遺傳病的研究策略第44頁例：非綜合征型先天缺牙分子遺傳學研究

JDentRes,;88:126-131EurJMedGenet,;51:536-546EurJMedGenet,;54:377-382單基因遺傳病的研究策略第45頁單基因遺傳病發病機制研究單基因遺傳病的研究策略第46頁——隱性突變往往造成失去功效（lossoffunction）——顯性突變可造成取得功效（gainoffunction）和失去功效失去功效：單倍劑量不足（halpoinsufficency）取得功效：顯性負效應（dominantnegtive）

隱性突變和顯性突變致病機制單基因遺傳病的研究策略第47頁Gainoffunction：

Loricrin基因突變取得核轉位新功效

BrJDermatol,;159:714-719

單基因遺傳病的研究策略第48頁Loricrin角皮病單基因遺傳病的研究策略第49頁連鎖分析與1q21區域連鎖單基因遺傳病的研究策略第50頁發覺Loricrin基因新突變單基因遺傳病的研究策略第51頁特殊臨床表現單基因遺傳病的研究策略第52頁突變蛋白序列新功效預測單基因遺傳病的研究策略第53頁GFP表示載體構建單基因遺傳病的研究策略第54頁細胞亞定位分析單基因遺傳病的研究策略第55頁動物模型過表示和基因敲除小鼠模型均表現正常表型轉基因小鼠表現出與人類疾病相同疾病表型，提醒突變基因取得功效為其發病機制。單基因遺傳病的研究策略第56頁基因敲除小鼠表型基礎正常單基因遺傳病的研究策略第57頁轉基因小鼠表型與人類疾病相同單基因遺傳病的研究策略第58頁結論

Loricrin基因突變可引發新疾病表型Loricrin突變蛋白取得新功效，經過其核定位信號介導了突變蛋白核轉位單基因遺傳病的研究策略第59頁Haploinsufficiency：

PAX6基因單倍劑量不足影響胰島素成熟過程造成糖耐受異常

Diabetologia.;52:504-13單基因遺傳病的研究策略第60頁先天性無虹膜家系單基因遺傳病的研究策略第61頁在該家系發覺

PAX6突變(c.1080C>T)造成單倍劑量不足

SSCPanalysis

DNAsequencing

單基因遺傳病的研究策略第62頁Tonetal.Cell67,1991PAX6

基因及其cDNA單基因遺傳病的研究策略第63頁Essentialforthedevelopmentoftheeye&brain

homozygous

mutants—noeyes,nobrain,die

heterozygousmutants—smalleyesinmiceaniridiainhumansEssentialforthedevelopmentofpancreas

homozygous

mutants—abnormalpancreaticstructurePAX6功效Hilletal.Nature354,1991;St-Ongeetal.Nature387,1997;Sanderetal.GenesDev11,1997單基因遺傳病的研究策略第64頁PAX6在胰腺發育中功效Mansourietal.TEM10,1999Dohrmannetal.MechDev92,單基因遺傳病的研究策略第65頁

PAX6在成體胰腺中功效Homozygousmicewithconditionalk/oPAX6inthepancreascauseddiabetes

FouraniridiapatientswithPAX6mutationswerereportedtosufferfromglucoseintolerance

Ashery-Padanetal.DevBiol269,Yasudaetal.Diabetes51,

單基因遺傳病的研究策略第66頁假說PAX6mutation?abnormalglucosehomeostasis單基因遺傳病的研究策略第67頁OGTTAnalysisintheAniridiaPedigreeIDAgeBMI(kgm-2)Glucoselevels(mmolL-1)ClinicalstatusAniridiaGenotype0’120’

Ⅱ-6Ⅱ-7Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-5Ⅲ-6Ⅲ-8Ⅲ-9Ⅲ-10Ⅲ-11Ⅲ-13706850434133304038363217.5820.2217.8820.8621.1520.4220.9920.4320.9622.9320.834.554.084.865.253.694.274.916.055.277.744.668.0412.9911.418.657.806.625.8814.579.7815.617.31IGTDDIGTIGTNGTNGTDIGTDIGT+++++++++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅣ-1Ⅳ-2Ⅳ-5Ⅳ-7Ⅳ-9171811161419.4120.3315.2819.4116.194.173.984.725.144.587.956.855.666.217.07IGTNGTNGTNGTNGT+

++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅢ-15Ⅲ-16Ⅲ-17Ⅲ-18Ⅲ-19Ⅳ-3Ⅳ-4Ⅳ-6Ⅳ-84138343330151171219.9321.1922.3020.4322.8317.3115.4215.0616.544.414.894.254.014.384.155.244.814.716.765.335.036.006.635.485.086.186.23NGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGT---------N/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/N單基因遺傳病的研究策略第68頁血糖和胰島素水平單基因遺傳病的研究策略第69頁總結1AniridiacausedbyPAX6genemutationPAX6mutationcausedimpairedglucosetolerance(IGT)PAX6-relatedIGTwasassociatedwithage單基因遺傳病的研究策略第70頁問題DoesIGTcomefromdeficiencyofinsulin?Dothesepatientshaveinsulinresistance?Dopatientshaveadefectininsulinprocessing?

單基因遺傳病的研究策略第71頁PAX6HadNoEffectontheTran