內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡在糖尿病膀胱逼尿肌病變進(jìn)展中作用的實(shí)驗(yàn)研究在泌尿系統(tǒng)受糖尿病影響而發(fā)生的一系列病理生理學(xué)改變中,十分常見且重要的一項(xiàng)即為糖尿病膀胱(diabetescystopathy,DCP)。已有研究證實(shí)其發(fā)病過程伴隨細(xì)胞凋亡水平的顯著升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)在蛋白合成后通過折疊修飾使之進(jìn)一步成熟的重要細(xì)胞器,對(duì)維持細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)具有重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERS)相關(guān)性凋亡是機(jī)體除線粒體凋亡途徑外又一條重要的內(nèi)源性激活途徑,包括細(xì)菌病毒感染、氧自由基堆積、離子泵功能障礙等多種體內(nèi)外因素均可使之激活。在應(yīng)激狀態(tài)下,ERS因應(yīng)激強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間的不同而觸發(fā)不同的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Cascade):應(yīng)激初期可代償性緩沖環(huán)境壓力,修復(fù)細(xì)胞;若應(yīng)激持續(xù)存在,則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse,UPR)是機(jī)體對(duì)抗應(yīng)激損害的重要機(jī)制,具體機(jī)制為:阻抑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶及折疊酶的轉(zhuǎn)錄激活,并暫停早期蛋白質(zhì)合成。同時(shí)對(duì)已堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù),最終使受損細(xì)胞得以存續(xù)。如果細(xì)胞損傷程度過重,UPR則轉(zhuǎn)入失代償階段,ERS相關(guān)性凋亡途徑占據(jù)優(yōu)勢(shì),最終誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡。GRP78是UPR特征性標(biāo)志物,而CHOP及Caspase12則被認(rèn)為是ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志因子。三者結(jié)合可以特異性地表征反映細(xì)胞ERS相關(guān)性凋亡所處階段及強(qiáng)度,已被廣泛應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究。糖尿病患者體內(nèi)存在諸如高血糖、氧化應(yīng)激、RAS系統(tǒng)激活、脂質(zhì)代謝障礙等多種可誘發(fā)ERS的因素。ERS可顯著促進(jìn)多種糖尿病并發(fā)癥(如糖尿病心肌病、糖尿病血管病變、糖尿病胃腸病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病肝病、糖尿病腎病等)發(fā)生進(jìn)展的現(xiàn)象已在近年來國內(nèi)外的諸多實(shí)驗(yàn)研究中被證實(shí),但其對(duì)DCP病理生理學(xué),特別是DCP逼尿肌病變發(fā)生進(jìn)展的影響目前仍不清楚,開展相關(guān)領(lǐng)域的研究對(duì)于更加充分深刻地認(rèn)識(shí)理解DCP的致病形成機(jī)理十分有意義。鑒于ERS相關(guān)性凋亡作為細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑中重要組成部分以及諸多糖尿病其它并發(fā)癥均被證實(shí)涉及ERS相關(guān)性凋亡的事實(shí),我們推測(cè):ERS相關(guān)性凋亡與DCP及其逼尿肌病變的發(fā)生進(jìn)展亦應(yīng)在病因?qū)W及病理生理學(xué)演變等方面具有相關(guān)性。為驗(yàn)證以上假說,我們通過第一部分動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了ERS相關(guān)性凋亡在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型逼尿肌病變進(jìn)展中的作用研究。主要內(nèi)容為:1.以鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射法構(gòu)建并鑒定糖尿病大鼠模型,在造模后不同時(shí)間點(diǎn)(STZ注射后4w、8w、12w和16w)依次測(cè)定各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及逼尿肌收縮力;2.運(yùn)用HE染色法及透射電子顯微鏡(Transmissionelectronmicroscope,TEM)分別觀察評(píng)估糖尿病模型大鼠逼尿肌隨病程進(jìn)展在光鏡下顯微結(jié)構(gòu)及電鏡下超微結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)演變,運(yùn)用VG(VanGieson)染色法檢測(cè)并計(jì)算比較各組糖尿病大鼠不同病程階段逼尿肌膠原纖維所占面積比例;3.運(yùn)用SABC免疫組化染色法檢測(cè)PCNA表達(dá)測(cè)定評(píng)估四個(gè)病程時(shí)點(diǎn)糖尿病模型大鼠逼尿肌細(xì)胞增殖水平,運(yùn)用TUNEL染色法測(cè)定評(píng)估四個(gè)病程時(shí)點(diǎn)糖尿病模型大鼠逼尿肌細(xì)胞凋亡水平;4.以qRT-PCR及Westernblotting法分別測(cè)定各組大鼠逼尿肌細(xì)胞三種ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志因子GRP78、CHOP及Caspase12在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化,并分析GRP78表達(dá)與PCNA陽性表達(dá)率演變之間的相關(guān)性以及CHOP和Caspase12表達(dá)與凋亡指數(shù)演變之間的相關(guān)性。大量研究表明,在糖尿病其它并發(fā)癥中,高葡萄糖血癥(Hyperglycemia)作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素可通過線粒體途徑直接誘導(dǎo)并加重細(xì)胞凋亡,但在DCP研究領(lǐng)域,高葡萄糖血癥是否能通過ERS途徑影響逼尿肌細(xì)胞病理生理狀態(tài)則鮮有報(bào)道。為了進(jìn)一步檢測(cè)高葡萄糖血癥通過影響ERS相關(guān)性凋亡途徑作用于DCP逼尿肌病變發(fā)生進(jìn)展的情況,在第一部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERS相關(guān)性凋亡與DCP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)計(jì)了第二部分體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),以體外高葡萄糖濃度環(huán)境模擬在體的高葡萄糖血癥,研究ERS對(duì)體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞(Detrusorsmoothmusclecells,DSMCs)凋亡的影響效應(yīng)。主要內(nèi)容如下:1.分離、原代培養(yǎng)并通過α-SMA免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定大鼠DSMCs,之后將大鼠DSMCs分為正常葡萄糖濃度組(NG組)及高濃度葡萄糖濃度組(HG組);2.兩組DSMCs在四個(gè)不同時(shí)點(diǎn)(12h、24h、48h和72h)在TEM下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)演變;3.運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)NG組及HG組在上述四個(gè)不同時(shí)點(diǎn)DSMCs增殖水平;運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)評(píng)估兩組DSMCs在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的凋亡水平;4.測(cè)定四個(gè)不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠DSMCs上述三種ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志因子在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化,并分析CHOP及Caspase12的表達(dá)與流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得凋亡率之間的相關(guān)性。第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型逼尿肌病變進(jìn)展中的作用機(jī)制研究第一節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進(jìn)展逼尿肌功能學(xué)演變觀察評(píng)估目的:觀察評(píng)估糖尿病模型大鼠隨病程進(jìn)展的一般狀況改變及其膀胱組織在尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及逼尿肌收縮力方面發(fā)生的功能學(xué)演變情況。方法:取成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠50只,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、糖尿病4周組(DM4w組)、糖尿病8周組(DM8w組)、糖尿病12周組(DM12w組)及糖尿病16周組(DM16w組),每組10只,共計(jì)5組。DM4w-DM16w四組大鼠同期采用一次注射法經(jīng)腹腔注射60mg/kg的STZ溶液構(gòu)建糖尿病大鼠模型,Control組同期給予腹腔注射等量不含STZ的緩沖液。糖尿病成模判定標(biāo)準(zhǔn)如下:注射后72h以刀片切割鼠尾末端行鼠尾靜脈取血,血糖儀三次測(cè)得血糖濃度若大于300mg/dL則判定該鼠已制備為糖尿病模型大鼠。在鑒定成模后分別于4w、8w、12w及16w分別對(duì)五組大鼠運(yùn)用壓力換能器及生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)行包括膀胱最大容量、逼尿肌漏尿點(diǎn)壓(DetrusorLeakPointPressure,DLPP)和順應(yīng)性等指標(biāo)在內(nèi)的尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè);并在不同病程時(shí)點(diǎn)對(duì)接受尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后的相應(yīng)組別大鼠即刻處死,Control組大鼠與DM4w組大鼠同期處死,取出膀胱并制備逼尿肌肌條,運(yùn)用生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)行逼尿肌收縮力測(cè)定。結(jié)果:成功構(gòu)建并鑒定獲得四個(gè)不同病程時(shí)點(diǎn)的糖尿病大鼠模型。各模型組大鼠隨病情進(jìn)展逐漸呈現(xiàn)出三多一少(多飲、多食、多尿,瘦弱減重)、萎靡遲緩、倦怠少動(dòng)、對(duì)痛感反應(yīng)鈍化。此外,還可見毛色轉(zhuǎn)為灰黃,眼球由紅轉(zhuǎn)白,呈現(xiàn)白內(nèi)障樣渾濁,肢體可見大小不一的多發(fā)潰瘍膿性創(chuàng)面等表現(xiàn)。四組糖尿病模型大鼠平均血糖水平、膀胱濕重及膀胱濕重/體重比值較對(duì)照組均顯著升高;各組糖尿病模型大鼠平均體重均顯著低于對(duì)照組大鼠,且隨病程進(jìn)展呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì);各糖尿病模型大鼠組膀胱最大容量、順應(yīng)性及DLPP均顯著高于對(duì)照組大鼠,且隨病程進(jìn)展逐漸升高;四組糖尿病模型大鼠逼尿肌平均收縮力均高于對(duì)照組大鼠,升高趨勢(shì)隨病程進(jìn)展在DM8w組達(dá)到峰值,DM12w組及DM16w組較DM8w組有所回落。結(jié)論:(1)糖尿病對(duì)膀胱逼尿肌的順應(yīng)性、興奮性、自律性均會(huì)造成損害,其收縮舒張功能障礙將引起一系列臨床癥狀。(2)糖尿病模型大鼠膀胱功能障礙的進(jìn)展呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。(3)糖尿病模型大鼠膀胱功能障礙的演變存在代償期向非代償期的過渡,過渡時(shí)段可能為成模后8-12w。第二節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進(jìn)展膀胱逼尿肌組織形態(tài)學(xué)演變觀察評(píng)估目的:觀察評(píng)估糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌隨病程進(jìn)展在顯微、超微結(jié)構(gòu)水平以及膠原纖維含量方面發(fā)生的組織形態(tài)學(xué)演變情況。方法:取DM4W、DM8W、DM12W及DM16W四組大鼠及Control組大鼠膀胱逼尿肌組織,完成以下三項(xiàng)檢測(cè)觀察:行HE染色后于光鏡下觀察各組大鼠逼尿肌組織顯微結(jié)構(gòu)變化;行VG染色后于光鏡下觀察各組大鼠逼尿肌間質(zhì)中膠原纖維并計(jì)算其面積所占百分比;接受組織特殊固定處理后在透射電鏡下觀察逼尿肌細(xì)胞包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等在內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:HE染色光鏡下觀察膀胱逼尿肌肌束隨病程進(jìn)展走行漸紊亂,局部出現(xiàn)排列松散及肌纖維間隙增大現(xiàn)象,肌束間疏松纖維結(jié)締組織漸增多且分布混亂;VG染色光鏡觀察見膠原纖維存在于逼尿肌間質(zhì)中,隨著糖尿病病程的進(jìn)展,膠原纖維所占面積比例逐漸增多。除DM4w組大鼠,其余實(shí)驗(yàn)組大鼠膀胱逼尿肌膠原纖維所占面積比例差異與對(duì)照組大鼠相比均顯著升高;透射電鏡下見逼尿肌細(xì)胞隨病程進(jìn)展逐漸出現(xiàn)核旁內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域的脫顆粒及空泡化改變,并伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常結(jié)構(gòu)的破壞;細(xì)胞核外形漸扭曲。到糖尿病病程12w之后,散在空泡化改變出現(xiàn)廣泛的融合現(xiàn)象,大量細(xì)胞核出現(xiàn)固縮及崩解現(xiàn)象,核仁漸消失并可見大量異常電子致密物沉積。結(jié)論:(1)隨著糖尿病病程的進(jìn)展,糖尿病模型大鼠出現(xiàn)不同程度的膀胱重構(gòu)現(xiàn)象,逼尿肌組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)進(jìn)行性破壞。(2)糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌間質(zhì)膠原纖維隨糖尿病病程的延長逐漸堆積增多,間質(zhì)纖維化程度逐漸升高,與膀胱順應(yīng)性的下降密切相關(guān)。(3)糖尿病成模后8w-12w是膀胱逼尿肌組織形態(tài)加速破壞惡化的關(guān)鍵時(shí)段,與逼尿肌功能在此期間經(jīng)歷由代償向失代償?shù)霓D(zhuǎn)變相對(duì)應(yīng)。第三節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進(jìn)展膀胱逼尿肌細(xì)胞增殖與凋亡水平演變的研究目的:測(cè)定糖尿病模型大鼠隨病程進(jìn)展膀胱逼尿肌細(xì)胞增殖及凋亡水平的演變情況。方法:取不同病程時(shí)點(diǎn)糖尿病模型大鼠及對(duì)照組大鼠膀胱逼尿肌組織切片,運(yùn)用SABC免疫組化染色法檢測(cè)PCNA表達(dá)測(cè)定評(píng)估四個(gè)病程時(shí)點(diǎn)糖尿病模型大鼠逼尿肌細(xì)胞增殖水平,行TUNEL染色計(jì)算并比較各組大鼠膀胱逼尿肌凋亡陽性細(xì)胞百分比。結(jié)果:隨著糖尿病病程的進(jìn)展,糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞PCNA平均陽性表達(dá)率與對(duì)照組大鼠相比均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陽性表達(dá)率均值在造模后8w檢測(cè)時(shí)點(diǎn)達(dá)峰,后逐漸回落,至造模后16w檢測(cè)時(shí)點(diǎn)時(shí),陽性表達(dá)率均值已與造模后4w檢測(cè)值相近持平,但仍高于control組水平;隨著糖尿病病程的進(jìn)展,各實(shí)驗(yàn)組大鼠平均凋亡指數(shù)與對(duì)照組大鼠相比均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),凋亡指數(shù)平均數(shù)值呈現(xiàn)逐漸增長趨勢(shì),提示細(xì)胞凋亡水平逐漸升高。結(jié)論:(1)糖尿病模型大鼠DSMCs細(xì)胞數(shù)量變化呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。(2)糖尿病模型大鼠DSMCs細(xì)胞凋亡水平較正常大鼠顯著升高,并隨糖尿病病程的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì);細(xì)胞增殖水平亦顯著高于正常大鼠,但存在漸次升高到逐漸回落的過渡。(3)成模后8w-12w對(duì)于糖尿病模型大鼠DSMCs的數(shù)量演變來說是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)折時(shí)段,是由增殖凋亡雙上升,但以增殖為強(qiáng)的代償階段逐漸過渡為增殖回落凋亡繼續(xù)走強(qiáng)占據(jù)主導(dǎo)的失代償階段。第四節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進(jìn)展膀胱逼尿肌細(xì)胞ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志物表達(dá)變化的研究目的:在測(cè)定糖尿病模型大鼠隨病程進(jìn)展膀胱逼尿肌細(xì)胞增殖及凋亡水平演變情況基礎(chǔ)上,通過對(duì)三種ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志因子在mRNA及蛋白水平表達(dá)變化的檢測(cè),初步評(píng)估ERS相關(guān)性凋亡在糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌病程進(jìn)展過程中的作用。方法:取不同病程時(shí)點(diǎn)糖尿病模型大鼠及對(duì)照組大鼠膀胱逼尿肌組織,以qRT-PCR及Westernblotting法分別測(cè)定各組大鼠逼尿肌細(xì)胞三種ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志因子GRP78、Caspase12及CHOP在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化,并分析上述三者表達(dá)與DSMCs增殖及凋亡水平演變的相關(guān)性。結(jié)果:各組糖尿病模型大鼠三種ERS相關(guān)性凋亡標(biāo)志因子GRP78、Caspase12及CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組大鼠,其中Caspase12及CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平隨病程進(jìn)展均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì),而GRP78的mRNA表達(dá)水平于DM12w組達(dá)到峰值,其蛋白表達(dá)水平于DM8w組達(dá)到峰值。GRP78蛋白及mRNA表達(dá)與逼尿肌細(xì)胞PCNA陽性表達(dá)率均呈顯著正相關(guān),而CHOP及Caspase12蛋白及mRNA表達(dá)與逼尿肌細(xì)胞AI均呈顯著正相關(guān)。結(jié)論:(1)UPR主導(dǎo)的細(xì)胞修復(fù)活動(dòng)與ERS相關(guān)性凋亡在DCP病程進(jìn)展過程中同時(shí)存在。(2)UPR主導(dǎo)的細(xì)胞修復(fù)活動(dòng)在成模后8w-12w時(shí)段經(jīng)歷了由代償性增強(qiáng)向失代償性減弱的轉(zhuǎn)變。(3)ERS相關(guān)性凋亡在DCP逼尿肌病變進(jìn)展過程中是一個(gè)持續(xù)發(fā)揮負(fù)性效應(yīng)且隨時(shí)間延長強(qiáng)度不斷增強(qiáng)的重要病理生理學(xué)事件。(4)糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌病變的發(fā)生發(fā)展與ERS相關(guān)性凋亡密切相關(guān)。第二部分:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞凋亡的影響研究第一節(jié)大鼠逼尿肌細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)、傳代及鑒定目的:通過適宜的體外分離、原代培養(yǎng)、傳代以及準(zhǔn)確明晰的鑒定,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)獲取活性良好的可靠DSMCs。方法:運(yùn)用膠原酶Ⅱ(4mg/mL)分離并原代培養(yǎng)DSMCs,之后通過α-SMA免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定大鼠逼尿肌細(xì)胞。結(jié)果:原代培養(yǎng)的大鼠DSMCs在光鏡下呈長梭形。分離后經(jīng)培養(yǎng)8h左右即可見細(xì)胞出現(xiàn)伸展貼壁現(xiàn)象,提示細(xì)胞活性良好。ɑ-SMA免疫熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下可見DSMCs的梭形胞質(zhì)呈現(xiàn)特異性的綠色熒光,提示胞質(zhì)內(nèi)特異性地表達(dá)平滑肌標(biāo)志蛋白ɑ-SMA;胞核則呈現(xiàn)DAPI特異性的藍(lán)色熒光。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫熒光染色陽性結(jié)果,可綜合判定所分離培養(yǎng)之細(xì)胞為DSMCs。結(jié)論:(1)采用適宜濃度及合理消化時(shí)間的膠原酶Ⅱ消化法可以高效快捷地分離出活性良好、生理性能穩(wěn)定的DSMCs。(2)運(yùn)用上述方法在24-48h內(nèi)分離得到的原代培養(yǎng)的DSMCs能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的要求。第二節(jié)體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察評(píng)估目的:在體外構(gòu)建單純的高糖環(huán)境,模擬在體的高葡萄糖血癥,觀察DSMCs在接受體外不同時(shí)長高濃度葡萄糖刺激下的情況下,細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的改變。方法:將細(xì)胞同步化處理后的DSMCs分為接種于高濃度葡萄糖(25mM)液體培養(yǎng)基組(HG組)及接種于正常濃度葡萄糖(5mM)液體培養(yǎng)基對(duì)照組(NG組)。接受特殊固定處理后在透射電鏡下觀察兩組DSMCs在接種后12h、24h、48h和72h四個(gè)不同時(shí)點(diǎn)的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:鏡下見NG對(duì)照組DSMCs細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,染色質(zhì)向核膜聚集分布;胞漿內(nèi)可見核周區(qū)域?qū)盈B分布的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其間散在分布的線粒體,形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的NG組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)亦未見明顯差異。與對(duì)應(yīng)NG組DSMCs相比,HG12h組及HG24h組DSMCs的鏡下表現(xiàn)并未見明顯的差異,部分細(xì)胞的核周區(qū)域可見空泡結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),但并非普遍現(xiàn)象。當(dāng)高糖刺激時(shí)長延至48h時(shí),在HG48h組DSMCs內(nèi)的核周區(qū)域開始出現(xiàn)較多量的囊泡結(jié)構(gòu),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸變得腫脹,并伴有輕度脫顆粒現(xiàn)象。部分細(xì)胞的核膜形態(tài)變得不規(guī)則,部分區(qū)域彎卷折疊,出現(xiàn)質(zhì)膜微囊。在持續(xù)接受高糖刺激72h之后,HG72h組的部分DSMCs細(xì)胞核出現(xiàn)扭曲固縮,體積變小,形態(tài)漸失常,并可見多量的黑褐色電子致密物沉積于核膜內(nèi)側(cè)區(qū)域,而核周的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體分布區(qū)域則未見明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步惡化的表現(xiàn)。此外,在各組細(xì)胞鏡下觀察時(shí)均可見到DSMCs典型的凋亡影像以及特征性的凋亡小體,NG組及HG12h組數(shù)量較少,高糖刺激24h后的各組細(xì)胞中則有所增多。結(jié)論:(1)體外高糖環(huán)境下DSMCs在接受不同時(shí)長(0-72h)刺激時(shí),其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)演變時(shí)間依賴性并不顯著。(2)各組細(xì)胞中均可觀察到典型凋亡小體結(jié)構(gòu),NG組及HG12h組數(shù)量較少,高糖刺激24h后的各組細(xì)胞中則有所增多。第三節(jié)體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞增殖及凋亡水平的演變目的:檢測(cè)并定量評(píng)估體外高糖濃度環(huán)境不同時(shí)長刺激對(duì)DSMCs增殖及凋亡水平的影響。方法:運(yùn)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定NG組及HG組對(duì)數(shù)生長期DSMCs在12h、24h、48h和72h四個(gè)不同時(shí)點(diǎn)的吸光值(OD值);運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法對(duì)細(xì)胞染色,并以流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩組DSMCs在上述四個(gè)時(shí)點(diǎn)的早期、晚期凋亡率以及總凋亡率。結(jié)果:除12h時(shí)點(diǎn)兩組的平均OD值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,HG組在24h、48h和72h的平均OD值均顯著低于NG組(P<0.05);NG組DSMCs平均OD值逐漸增高,HG組DSMCs平均OD值則隨接受刺激時(shí)間的延長逐漸降低。與NG組DSMCs相比,除HG12h組早期、晚期及平均總凋亡率與之基本持平,數(shù)據(jù)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,HG24h組、HG48h組、HG72h組DSMCs的早期、晚期及平均總凋亡率均顯著升高(P<0.05)