關于細胞形態(tài)學檢查第2頁,共74頁，2024年2月25日，星期天IdentificationofculturedadultratRGCs.Culturedcellswereco-labeledwithanti-Thy-1antibody(A),anti-NF-Lantibody(B),andDAPI(C).(D)Adigitallymergedimagesimultaneouslyrepresentsallthreefluorescentlabels.(E)Thecorrespondingphase-contrastimage.第3頁,共74頁，2024年2月25日，星期天免疫熒光染色法用于標記二抗體的熒光素：（1）異硫氰酸熒光素（FITC）發(fā)射的熒光波長為490～619（綠色熒光）（2）四乙基羅丹明：熒光波長為540～660（橙紅色熒光）（3）DAPI或Hoechst33258:染核，用紫外激發(fā)

第4頁,共74頁，2024年2月25日，星期天免疫熒光的染色步驟1、用95%乙醇固定細胞10-30分或用冷丙酮固定5～10分。2、用PBS洗3次。3、用PBS配制的1‰Triton10分。用PBS洗3次4、用2%～5%BSA封閉2小時5、加入一抗過夜，PBS洗3次6、加入二抗1～2小時，PBS洗3次7、核復染，熒光顯微鏡觀察。第5頁,共74頁，2024年2月25日，星期天正常細胞和組織的培養(yǎng)一、上皮細胞培養(yǎng)(epithelialculture)

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關鍵。第6頁,共74頁，2024年2月25日，星期天體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。

第7頁,共74頁，2024年2月25日，星期天表皮細胞培養(yǎng)1、取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊，早產流產兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。

6、反復吹打，制成懸液。

7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

第8頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共74頁，2024年2月25日，星期天CulturedMouseMammaryEpithelialCells第10頁,共74頁，2024年2月25日，星期天神經(jīng)膠質細胞培養(yǎng)

神經(jīng)細胞（神經(jīng)元〕不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質細胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質細胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，第11頁,共74頁，2024年2月25日，星期天獲取腦組織后，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時腦組織比較柔軟，反復吹打即制成細胞懸液。

3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細胞成分。

4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)過濾，計數(shù)并調整細胞密度。

5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

該細胞適應環(huán)境過程較長，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內也可能不見細胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長后即能迅速進入旺盛的增殖狀態(tài)。細胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。

第12頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Culturedneuron第13頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Culturedmicroglia第14頁,共74頁，2024年2月25日，星期天大鼠肝細胞的培養(yǎng)(成年)培養(yǎng)液:Koga培養(yǎng)液,最好加入Williams和WaymouthMB752/1)消化液:

型膠原酶300U/mg,使用濃度為0.025%方法:1灌流法分離肝細胞：門靜脈和下腔插管靜脈插管2、用預灌流液(8.3mg/mlNaCl,0.5mg/mlKCl,2.4mg/mlHEPES,pH7.4)灌流8分鐘

第15頁,共74頁，2024年2月25日，星期天3、用含0.05%膠原酶的灌流液(預灌流液中加入5mmol/LCaCl2,0.05%膠原酶)繼續(xù)灌流10分鐘。4、將肝葉剪下,將消化好的肝細胞輕輕刮下,獲得的肝細胞懸液離心(600r/min)三次,每次2分鐘5、然后重新懸浮于WE培養(yǎng)基中(含10%血清,Insulin0.2U/ml,L-Glutamine0.292mg/ml，100nMdexamethasone)。6、IsolatedcellswereplatedoncollagentypeI-coateddishesinmediumIconsistingofWilliams‘mediumE。第16頁,共74頁，2024年2月25日，星期天HepatocyteIsolationandCulture

HepatocyteswereisolatedfromtheliveroffedmaleBALB/cmice(22-25g)byusingthetwo-stepcollagenaseperfusionmethod.Aftertheinductionofanesthesiawithpentobarbitalsodium(400

mg/kgip),theperitonealcavitywasopened,andtheliverwasperfusedinsituviatheportalveinfor4

minat37°Cwithcalcium-freeHEPESbufferandfor7

minwithHEPESbuffercontaining45

mg/100mlcollagenaseD(Boehringer-Mannheim,Laval,QC,Canada)and135

mg/100mlCaCl2.Theperfusionratewassetat5

ml/minforbothsolutions.第17頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Thecellswereusedonlyifcellviability,asdeterminedbytrypanblueexclusion,was>80%.Thecellswereseededontoplasticpetridishes(26,000

cells/cm2)inWilliams'mediumE(GIBCOBRL,Toronto,ON,Canada)supplementedwith10%fetalbovineserum(GIBCOBRL)andallowed90

mintoattach.Theserum-containingmediumwasthenremoved,andthecellsweresubjectedtodifferentcultureconditionsinserum-freemedium.第18頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Fig.5.

MorphologyofEGF-treatedmousehepatocytesinthepresenceandabsenceofPD-168393.Primarymousehepatocytecultureswereincubatedwithmedium(untreated)orEGF(50

ng/ml)inthepresenceorabsenceof10

μMPD-168393.After24

hinculture,EGF-treatedhepatocyteswerespread,andtheircellsurfaceincreasedcomparedwithuntreatedcells.HepatocytestreatedwithEGFinthepresenceofPD-168393werespheroidandresembledcontrolcellswithorwithoutPD-168393.Magnification,×100.

第19頁,共74頁，2024年2月25日，星期天大鼠心肌細胞的培養(yǎng)新生大鼠鼠齡的選擇

新生大鼠心肌細胞在出生后3d內具有部分的增殖能力,成年大鼠心肌細胞則為終末分化細胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出生時間越短,其心肌細胞分離后成活率越高,越容易貼壁生長.大量觀測表明,選擇13d齡大鼠分離其心肌細胞進行原代培養(yǎng)較為理想.其中尤以半日齡大鼠心肌細胞培養(yǎng)效果最佳.第20頁,共74頁，2024年2月25日，星期天神經(jīng)細胞分散培養(yǎng)

（一）選材常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。

第21頁,共74頁，2024年2月25日，星期天(二）取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養(yǎng)。（三）細胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數(shù)，預置細胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

第22頁,共74頁，2024年2月25日，星期天（四）抑制膠質細胞生長。培養(yǎng)3-5d后，也有人認為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質細胞的生長。

（五）觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細胞生長突起明顯，5-7d膠質細胞增生明顯，7-10d膠質細胞成片于神經(jīng)細胞下面，形成地毯，2周時神經(jīng)細胞生長最豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經(jīng)細胞開始退化，變形，甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周最宜。

第23頁,共74頁，2024年2月25日，星期天但神經(jīng)細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而且隨培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量在下降，但膠質細胞可以，神經(jīng)膠質細胞也可以。在培養(yǎng)過程中，早期9-12d時，有較多的神經(jīng)細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成突觸。

第24頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Neuronalculture1.Ratpupsagedl-l5d,werekilledbycervicaldislocation.2.CortexplacedinEarle’sbalancedsaltsolution(BSS)at37°C.andcutinto500urnslices3.Slicesofvisualcortexwereincubatedat37°Cwithgentlestirringin10mlofenzymesolution4.After1.5hr.thesliceswererinsedbrieflywithEarle’sBSScontainingBSA,1mg/ml.5.Theslicesweregentlytrituratedwithafire-polishedPasteurpipetin2-3mlofthissolution.第25頁,共74頁，2024年2月25日，星期天FreshlydissociatedcellsthatexcludedthedveErythrosinB(Phillips,1973)wereconsideredtobeviable.Dissociatedcellswereharvestedbylow-speedcentrifugation(10min,70xg)through5mlofEarle’sBSScontainingBSA(10mg/ml).Cellswereresuspendedingrowthmediumandplatedinmodifiedpetridishes.Typically,cellsfromasingleratpupwereusedtoprepare40-50culturedishes.Optimalviabilityandmorphologicalpreservationofthedissociatedcellswereobtainedusingtheenzymepapain.第26頁,共74頁，2024年2月25日，星期天血管內皮細胞的培養(yǎng)取材人和動脈不同部位、不同血管如大動脈與小動脈、毛細血管，以及靜脈血管之間存在差異，在處理這些細胞時應分別對待。血管內皮細胞形態(tài)較小，近似圓形，呈均勻排列，一般取材于人和動物的臍帶。第27頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

人大動脈內皮細胞培養(yǎng)

人大動脈內皮細胞可來自手術、病理活檢組織，也可來自尸體（需在死后24h內取材)方法:(1)小心剝除已游離的大血管外膜，置于盛有冷的磷酸鹽平衡鹽溶液平皿中反復漂洗，洗凈血管內、外面的血液和脂質。（2）剪開血管，放入37℃消化液中，60min，消化結合后，用23號針頭注射器吸取消化液沖洗血管內腔，（3）收集消化液置無菌試管中，離心（1000rpm7min）棄上清，加入含血清培養(yǎng)基中，使細胞重新懸并調整細胞數(shù)。（4）接種于相應大小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，37℃恒溫溫箱培養(yǎng)，一周后內皮細胞可長成單層，呈多角形鋪成石狀排列。第28頁,共74頁，2024年2月25日，星期天注意事項：①如果小于23號針頭則回收內皮細胞效果差，若針頭過大則注射器內壓大會吸入緊貼內皮細胞的平滑肌細胞，因此注意使用恰當?shù)尼橆^；②人血管內皮細胞對營養(yǎng)條件要求高，是依賴于生長因子的一種細胞。常用的培養(yǎng)基為RPMI1640，培養(yǎng)時添加15%FBS，15%Nu-Serum，5～20μg/ml的內皮細胞生長因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。改進的培養(yǎng)基有MCDB109培養(yǎng)基，市場上也有內皮細胞商品培養(yǎng)基，可根據(jù)需要選擇購買；③培養(yǎng)基中必須加入相應抗生素，最終濃度：慶大霉素為15μg/ml，氨芐青霉素為50μg/ml，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四環(huán)素1μg/ml。在48h內可以防止細胞感染，3日后還應添加慶大毒素。第29頁,共74頁，2024年2月25日，星期天臍帶靜脈內皮細胞培養(yǎng)在嬰兒出生時立即將臍帶放置于無菌的500ml磷酸鹽溶液（PBS）中低溫保存。次日分離細胞。臍帶有一根靜脈兩根動脈，通常用內腔大靜脈。將洗凈的靜脈一端用夾子夾緊，一端注入消化液，靜置孵育片刻。然后PBS或培養(yǎng)液反復抽吸內腔，收集后與消化液一并離心、沉淀內皮細胞。所用培養(yǎng)基與大動脈內皮細胞培養(yǎng)基相同，臍帶靜脈內皮細胞、大動脈內皮細胞易于培養(yǎng)，既使不加生長因子在最初幾代細胞也會增殖良好。第30頁,共74頁，2024年2月25日，星期天血管內皮細胞重要標志

（1）第Ⅷ因子關連抗原（vonwillebrandfactor,VWF），可以由全身所有血管內皮細胞產生，檢測這一因子主要用相應抗體。VWF有其特異性，人的VWF抗體對牛的內皮細胞沒有交叉反應。兔疫熒光間接法測定該因子，陽性細胞出現(xiàn)細長的熒光顆粒，在核周圍的顆粒較密，細胞邊緣顆粒較少。（2）Weibel-Palade小體，該小體是血管內皮細胞又一特異性的標志。電子顯微鏡下，呈現(xiàn)0.1～0.3μm,長0.5～5μm的橢圓形棒狀結構。上述的VWF就是該小體產生的。第31頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共74頁，2024年2月25日，星期天血管平滑肌細胞的培養(yǎng)

血管平滑肌細胞培養(yǎng)常用的方法有貼塊法（explant）和酶解離法（enzymedisperse）。貼塊法具有獲得平滑肌細胞純度高，量多，操作簡便的優(yōu)點。但用貼塊法易使平滑肌細胞胞質內肌絲喪失，亞細胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細胞間失去連接，細胞內肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)。培養(yǎng)平滑肌細胞常取材于兔、豬、鼠、猴的胸腹主動脈段。第33頁,共74頁，2024年2月25日，星期天1．貼塊法方法：動物經(jīng)頸動脈放血后，在無菌操作下迅速取出胸腹主動脈段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開血管，刮除內膜即內皮細胞迅速撕下中膜內、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank's液中，并將撕下小組織塊種植于培養(yǎng)瓶壁。置于37℃恒溫箱，2h左右，取出培養(yǎng)瓶加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液，再放回培養(yǎng)箱內靜止培養(yǎng)4天。4天后可見細胞從組織中遷移游出。第34頁,共74頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)時注意事項為了保證培養(yǎng)的成功，應注意：①種植組織塊的數(shù)目，如75cm2的長頸瓶組織塊不得少于30個；②根據(jù)培養(yǎng)細胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應加胎牛血清（FBS），通常濃度為10%～20%；③培養(yǎng)基的選擇：常用的有DMEM（Dulbecco'smodifiedEagles'medium），M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)兔的平滑肌細胞用DMEM效果較好。第35頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2．酶解離法沿動脈縱軸切開后，刮除內皮細胞撕下中膜的內2/3，注意不要混入內皮細胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養(yǎng)基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重復上述消化步驟，然后再離心（9000r,4min），收集細胞，在5%～10%同種血清或胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調整細胞數(shù)，然后轉入30～90mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，對于兔子應加入高濃度的谷氨酰胺（0.2g/L）較佳。不同研究者在培養(yǎng)基、酶濃度以及消化時間等的選擇都有很大的差異。第36頁,共74頁，2024年2月25日，星期天動脈平滑肌的特性

由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細胞培養(yǎng)的最初階段細胞形態(tài)和性質存在差異。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)環(huán)境趨于一致，細胞特性上也趨于近似。光學倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細胞形狀多樣，一般常為梭形、帶形、三角形或星形。貼塊法培養(yǎng)，細胞可于2周后長成單層；而酶解離只需6～7天，鏡下可見明顯“峰-谷”樣生長。第37頁,共74頁，2024年2月25日，星期天牙髓細胞的培養(yǎng)

培養(yǎng)用液：PBSA；膠原酶：I型，用D－Hank’s液配制，625U/ml；培養(yǎng)液：DMEM＋10％FBS；Protocol：取拔除的正畸牙或阻生牙（年齡小者較佳），盡量完整的取出牙髓，置于培養(yǎng)皿中，用PBS沖洗；將牙髓放入離心管，加入膠原酶2－3ml/牙，37℃，2－3小時（原則是將牙髓消化徹底）；加入等量培養(yǎng)液，吹打至單細胞，離心，重懸，接種，牙/6well；第38頁,共74頁，2024年2月25日，星期天牙周細胞的培養(yǎng)

培養(yǎng)用液：PBSA；膠原酶：I型，用D－Hank’s液配制，625U/ml；培養(yǎng)液：DMEM＋10％FBS；Protocol：取拔除的正畸牙或阻生牙（年齡小者較佳），置于培養(yǎng)皿中，用手術刀仔細刮除附著在牙根上的牙齦組織，然后用PBS反復沖洗，以去除殘余組織以及牙根表面的血細胞；將牙放入離心管，加入膠原酶2－3ml/牙，37℃，1小時；加入等量培養(yǎng)液，仔細吹打牙根表面，收集細胞，離心，重懸，接種，牙/6well；*培養(yǎng)獲得的細胞是牙周膜細胞和成牙骨質細胞的混合體!第39頁,共74頁，2024年2月25日，星期天年齡對細胞產量以及活力影響較大，最好選用年齡在10－14歲之間的正畸牙或阻生牙；如果選用大鼠牙齒作為培養(yǎng)目標，培養(yǎng)液應稍作調整，基本原則是抑制細胞的衰老，具體做法是：適當降低血清濃度（選用進口血清最佳），如果降低血清濃度后，細胞增殖減慢，可加入促進細胞增殖的因子（例如BPE25ug/ml等）。第40頁,共74頁，2024年2月25日，星期天巨噬細胞培養(yǎng)

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。

培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用，其法如下：

1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內！），

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。

第41頁,共74頁，2024年2月25日，星期天5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10mlEagle培養(yǎng)基。

9、計數(shù)細胞。每只鼠可產生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。

10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。第42頁,共74頁，2024年2月25日，星期天干細胞（stemcells)的培養(yǎng)概念：來自胚胎、胎兒或成體未分化的具有無限或長期自我維持和自我更新能力的細胞性質：能自我更新能產生許多分化的后裔分類：根據(jù)組織來源：（1）胚胎干細胞（embryonicstemcell,ES)

（2）成體干細胞（adultstemcell,AS)第43頁,共74頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞的培養(yǎng)胚胎干細胞（ES）是指來自胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的內細胞團.胚胎干細胞培養(yǎng)的主要問題是保持干細胞于為分化狀態(tài)。通常是將胚胎干細胞種植在鋪有一層經(jīng)絲裂霉素C處理的成纖維細胞（飼細胞）上或在細胞培養(yǎng)液中加入白血病細胞生長抑制因子（LIF）以防止ES細胞分化。第44頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ES的生物學特性ES細胞在體外分化抑制培養(yǎng)基中呈克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起，形式鳥巢，細胞界限不清，克隆周圍可見有單個的ES細胞和分化的扁平狀上皮細胞。ES細胞為正常的二倍體細胞，胞體體積大，胞質結構簡單。能檢測到早期胚胎細胞中表達的階段特異性胚胎抗原。第45頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共74頁，2024年2月25日，星期天小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)（一）材料1、將配種后3.5天小鼠斷頸后處死,剪開腹腔取出子宮角,沖胚液沖洗后,收集胚胎.2培養(yǎng)液：ES培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（高糖）3飼養(yǎng)層細胞（二）方法1、將小鼠囊胚隨機放入鋪有飼養(yǎng)層細胞的4孔培養(yǎng)板上，每孔一枚，加入5mlES培養(yǎng)液培養(yǎng)第47頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2、培養(yǎng)24、48、72小時分別記錄胚胎貼壁細胞的生長行為，48小時后可見ICM迅速生長。3、4～5天后，ICM長成一簇簇的細胞團且未有分化現(xiàn)象，形似鳥巢狀的小鼠細胞團衍生物。用無菌玻璃針撥動，使其與滋養(yǎng)層細胞分開，將細胞用胰酶消化成單個細胞。4、將細胞重新接種在鋪有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)板。第48頁,共74頁，2024年2月25日，星期天干細胞系的培養(yǎng)步驟：

1．從液氮中取出一管細胞；

2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好完全溶解）；

3．將細胞轉移到一15mlFalcon管中；

4．加入5mlES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；

5．離心3分鐘；

6．棄上清，用2mlES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；

7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；

8．孵育。

第49頁,共74頁，2024年2月25日，星期天細胞傳代

建議每2天傳代細胞一次，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細胞，在將細胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過將分化細胞黏附在沒有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。

1．去除培養(yǎng)液；

2．無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；

3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。

4．加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活；

5．將細胞轉入15ml離心管中離心3min；

6．去除上清，將細胞重懸于2mlES培養(yǎng)基，至少吹打10－20次。

第50頁,共74頁，2024年2月25日，星期天如果加入培養(yǎng)基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。

7．將細胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時（分化細胞在該時間內將黏附，而ES細胞仍將保持懸浮）；

8．將含有細胞的培養(yǎng)基轉入geltin包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細胞被分散開（前面已經(jīng)提到--ES細胞有聚集成團的傾向）

9．建議按1：4－1：10的比率傳代(ATCC)

保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗，1：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進行細胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。第51頁,共74頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞培養(yǎng)①原代細胞的培養(yǎng):將剛出生的SD大鼠用75%酒精消毒后,頸椎脫臼處死,放入高壓滅菌的培養(yǎng)皿中,于解剖顯微鏡下分離出全腦,剝離腦膜和血管,收集腦室下區(qū)的組織,放入D-Hank’s液中漂洗兩次。將分離的腦室下區(qū)組織放入4℃基礎培養(yǎng)液中,剪切成0.5mm3的小塊,加入0.25%的trysine在37℃下震蕩消化20～30min。離心、棄上清,再用基礎培養(yǎng)液清洗兩次。然后,經(jīng)高壓消毒的40μm不銹鋼網(wǎng)過濾,用滴管輕輕地吹打制成單細胞懸液,計數(shù)并調整細胞的密度。以第52頁,共74頁，2024年2月25日，星期天接種于預先置有Poly-L-lysine的24孔和6孔培養(yǎng)板(costar)中。培養(yǎng)液為含有10%FCS的DMEM/F12(1∶1)。培養(yǎng)24h以后,將培養(yǎng)液換成無血清的完全培養(yǎng)液(DMEM/F12加N2、bFGF10μg/L、EGF20μg/L、heparin4×104U/L、青霉素1×105U/L及鏈霉素1×106U/L),于37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)7d,每隔2d半量換液1次。②傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)7d后的貼壁細胞及在貼壁細胞上形成的細胞球,經(jīng)吹打收集于離心管中。離心、棄上清,以滴管輕輕吹打后,用完全培養(yǎng)液制成單細胞懸液,進行臺盼藍染色并計數(shù)。以2×105個細胞接種于75mL(NUNC)和6孔培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)7d,每隔2d半量換液1次。此后,每隔7d傳代1次,在顯微鏡下用滴管將形成的克隆球輕輕打成45瓣進行傳代。第53頁,共74頁，2024年2月25日，星期天②傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)7d后的貼壁細胞及在貼壁細胞上形成的細胞球,經(jīng)吹打收集于離心管中。離心、棄上清,以滴管輕輕吹打后,用完全培養(yǎng)液制成單細胞懸液,進行臺盼藍染色并計數(shù)。以2×105個細胞接種于75mL(NUNC)和6孔培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)7d,每隔2d半量換液1次。此后,每隔7d傳代1次,在顯微鏡下用滴管將形成的克隆球輕輕打成45瓣進行傳代。第54頁,共74頁，2024年2月25日，星期天傳代培養(yǎng)7天的克隆細胞球第55頁,共74頁，2024年2月25日，星期天腫瘤細胞的培養(yǎng)腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養(yǎng)的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用第56頁,共74頁，2024年2月25日，星期天組織培養(yǎng)腫瘤細胞生物學特性

腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細胞具以下突出特點：第57頁,共74頁，2024年2月25日，星期天（－）形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規(guī)則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關第58頁,共74頁，2024年2月25日，星期天（二）生長增殖

腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力。正常細胞發(fā)生轉化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。另外癌細胞增殖數(shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。第59頁,共74頁，2024年2月25日，星期天（三）永生性

永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系或細胞株都表現(xiàn)有這種性狀，從近年建立細胞系或株的過程說明，如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的，腫瘤細胞應易于培養(yǎng)。事實上，多數(shù)腫瘤細胞初代培養(yǎng)時并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控，但卻有相關性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。第60頁,共74頁，2024年2月25日，星期天（四）浸潤性

浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。第61頁,共74頁，2024年2月25日，星期天（五）異質性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細胞獲得血液供應多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱干細胞（StemCells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養(yǎng)時易于生長增殖；把干細胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細胞培養(yǎng)。第62頁,共74頁，2024年2月25日，星期天（六）細胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細胞有遺傳學改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有干細胞系和數(shù)個亞系，并不斷進行著適應性演變。第63頁,共74頁，2024年2月25日，星期天腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質成纖維細胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關系，可能影響癌細胞增殖生長的活性；第64頁,共74頁，2024年2月25日，星期天②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋，達不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細胞的生長增殖力；③并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的LifeSpan，只有干細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數(shù)量很少；④離體培養(yǎng)腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。第65頁,共74頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)方法

腫瘤細胞培養(yǎng)成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細胞培養(yǎng)與正常組織細胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。第66頁,共74頁，2024年2月25日，星期天腫瘤細胞培養(yǎng)1．取材：

人來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進行培養(yǎng)，如因故不能立即，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時。

第67頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2