RNA聚合酶Ⅰ抑制劑CX-5461對銀屑病及相關病理性血管新生的藥理作用研究背景銀屑病是一種常見的慢性免疫炎癥性增生性皮膚病,病程長,且易復發。臨床表現主要以紅斑,鱗屑,瘙癢為主。銀屑病的主要組織病理學表現為表皮細胞過度角化,炎細胞浸潤以及毛細血管增生。銀屑病的病因及發病機制目前尚不完全清楚。但目前認為銀屑病的發生不是單一因素的結果,可能涉及多個方面,如遺傳背景、感染、免疫異常、內分泌因素、精神緊張等。目前,臨床上用于治療銀屑病的藥物副作用大,并且無法達到根治的目的。因此尋找新的藥物靶點具有十分重要的意義。CX-5461是一種新型的特異性RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)抑制劑。以往研究證實,CX-5461能夠抑制腫瘤細胞增殖,對某些白血病和實體腫瘤表現出較好的治療效果。我們課題組在前期研究中發現,CX-5461對機械損傷引起的動脈血管內膜增生和再狹窄有顯著的抑制作用,對移植后血管新生內膜增生和血管炎癥的發展也有抑制作用,并且CX-5461能夠有效抑制心肌成纖維細胞的活化及表型轉化。CX-5461是否對銀屑病病變的發生發展有抑制作用目前尚沒有研究。研究目的在本研究中,我們使用成熟的銀屑病模型和血管新生模型,探索PolⅠ特異性抑制劑CX-5461對銀屑病以及內皮細胞血管新生功能的藥理作用。研究方法用咪喹莫特乳膏處理C57BL/6小鼠皮膚建立銀屑病模型。CX-5461溶于DMSO中,局部皮膚涂抹給藥。將小鼠隨機分成4組:正常對照組(sham)、造模+DMSO組(溶劑對照)、造模+CX-5461低劑量組(2μM)、造模+CX-5461高劑量組(5μM)。局部涂抹治療1周后,取材進行組織病理學和分子生物學檢測。HE染色觀察角質層厚度變化。免疫組織化學染色觀察炎癥細胞CD68陽性細胞數量。Lectin和CD31染色觀察血管新生情況。用實時定量PCR方法檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL)-17、IL-23、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1[β的表達。體外培養人角質形成細胞(Hacat),用流式細胞術檢測細胞周期。用皮下種植海綿墊以及腹部皮下注射Matrigel方法建立血管新生模型。將種植海綿墊的C57BL/6小鼠隨機分成4組:生理鹽水對照組、血管內皮生長因子(VEGF)刺激組、CX-5461組、CX-5461+VEGF組。將腹部皮下注射Matrigel的C57BL/6小鼠隨機分成3組:Matrigel組、CX-5461低劑量組(2μM)組、CX-5461高劑量組(55μM)。2周后取材進行組織學檢測。免疫組織化學及Lectin染色觀察新生血管數量的變化。體外培養人毛細血管內皮細胞,用CCK-8法檢測細胞增殖能力,用劃痕實驗檢測細胞遷移能力,用小管成型實驗檢測細胞的成管能力,用流式細胞術檢測CX-5461對細胞周期的影響。用Westernbolt檢測內皮細胞中p53及磷酸化p53的蛋白水平。研究結果在銀屑病模型中,CX-5461明顯改善了銀屑病的皮膚癥狀(病變皮膚表面鱗屑減少,皮膚皺褶減少,紅腫明顯減輕)。HE染色結果顯示,與溶劑對照組相比,CX-5461治療明顯抑制了角質細胞的增生。免疫組織化學染色發現,CX-5461治療組病變部位的新生血管數量與溶劑對照組相比明顯減少。另外我們發現CX-5461能夠減輕病變部位的炎癥反應。免疫組織化學檢測結果顯示,與對照組相比,CX-5461治療組CD68+細胞數明顯減少。實時定量PCR結果顯示CX-5461治療組TNF-α、IL-17、IL-23、IL-lβ的表達水平下降,而IL-6、IL-8、IL-10的表達升高。在皮下種植PVA海綿墊血管新生模型中,CD31染色及Lectin化學染色顯示,VEGF組與對照組相比血管數量明顯增加;CX-5461治療顯著減少了基礎水平和VEGF刺激后的血管新生過程。在Matrigel膠血管新生模型中,CD31免疫化學染色顯示,CX-5461治療顯著減少了血管新生數量。體外培養的細胞中,CX-5461對血管內皮細胞的增殖有劑量依賴性的抑制作用。同時,CX-5461能明顯抑制血管內皮細胞的遷移能力和成管能力。并且,CX-5461對角質形成細胞和內皮細胞的細胞周期有抑制作用,可以將細胞阻滯在G2/M期。在血管內皮細胞中,CX-5461對p53蛋白總量的作用不明顯,但能顯著增加p53磷酸化水平。用p53抑制劑PFT-α預處理能夠減輕CX-5461對內皮細胞遷移的抑制作用,而對內皮細胞成管能力的作用不明顯。結論局部應用CX-5461