ICS65.120

B46

備案號：62091-2019DB21

遼寧省地方標準

DB21/T3061—2018

飼用微生物制劑中糞腸球菌的檢測方法

MethodfordetectionofEnterococcusfaecalisinfeedingmicrobialpreparations

DB21/T3061—2018

飼用微生物制劑中糞腸球菌的檢測方法

1范圍

本標準規定了飼用微生物制劑中糞腸球菌的檢驗方法。

本標準適用于含有益微生物糞腸球菌的各種飼料添加劑中糞腸球菌的檢測和計數。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

GB/T8170數值修約規則與極限數值的表示和判定

GB/T14699.1飼料采樣

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T20195動物飼料試樣的制備

3稀釋液、培養基及試劑

實驗用水的電導率在25℃時不應超過25μS/cm(相當于電阻率≥0.4ΜΩcm)，除非另有規定要求。水的

微生物污染不超過103CFU/mL。應按GB4789.2執行，采用平板計數瓊脂培養基，在36℃±1℃培養48h±2

h進行定期檢查微生物污染。

3.10.85%滅菌生理鹽水。

3.2糞腸球菌瓊脂培養基：見附錄A中A.1。

3.3哥倫比亞血瓊脂培養基：見附錄A中A.2。

3.4革蘭氏染色液：見附錄A中A.3。

3.5革蘭氏陽性菌鑒定卡或生化鑒定試劑。

3.6PCR鑒定試劑盒。

4標準菌株糞腸球菌ATCC29212。

5設備和玻璃器皿

5.1恒溫培養箱：精度36℃±1℃。

5.2高壓滅菌鍋：使用溫度為121℃。

1

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5.3微生物鑒定儀。

5.4渦旋儀：0r～2500r/min。

5.5麥氏比濁儀：量程0MCF～5MCF。

5.6顯微鏡：放大倍數400以上。

5.7無菌采樣袋/瓶。

5.8天平：0.00g～410.00g。

5.9冰箱：2℃～8℃。

5.10離心管：裝量為50mL。

5.11玻璃或塑料平皿：直徑為90mm。

5.12L形玻璃或塑料涂布棒。

5.13吸管或移液器：容量為0.1mL、1mL、10mL。

5.14廣口瓶或三角瓶：容量為500mL。

6采樣

實驗室樣品具有真實性和代表性。采樣人應佩帶無菌手套和口罩。采樣工具，如鏟子、匙、采樣器、

試管、廣口瓶、剪子等，應為無菌器皿。樣品采集后置于2℃～8℃環境內冷藏保存。采樣數量和方式按

GB/T14699.1執行。

7試樣的制備

按GB/T20195執行。

8操作步驟

8.1檢樣制備及稀釋

在超凈工作臺中稱取試樣25g（mL），加入盛有225mL0.85%滅菌生理鹽水的三角瓶中（瓶內預置

適當數量的玻璃珠）。置振蕩器上，振蕩30min。經充分振搖后，采用0.85%滅菌生理鹽水進行1:10的稀

釋。用滅菌吸管吸取1:10的均勻稀釋液1mL，置于滅菌的9mL0.85%滅菌生理鹽水離心管中，密封，渦

旋儀渦旋10s，經充分混勻后制成1:100的稀釋液。根據樣品含菌量，按上述稀釋次序遞次稀釋至相應要

求的稀釋倍數。

8.2接種和培養

選擇2個或者3個適宜的稀釋度，用滅菌吸管分別吸取0.1mL，接種到糞腸球菌瓊脂平皿（3.2）上，

每個濃度接種兩個平皿，使用無菌的涂布棒快速、準確地涂布接種于培養基表面。涂布棒不得接觸平皿

邊緣。每個平皿用一支無菌涂布棒。涂布好的平皿蓋上平皿蓋后，室溫放置15min，使接種物完全被培

養基吸收為止。翻轉上述平皿置36℃±1℃恒溫培養箱（4.1）中培養48h±1h。

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DB21/T3061—2018

8.3菌落計數及篩選

培養后，選取典型菌落數在30個～300個之間的平板計數。典型糞腸球菌菌落呈圓形，表面光滑、

隆起，菌落呈黑色或淡黑色，直徑在0.5mm～2.0mm大小的菌落。然后從中選出5個特征菌落進行確證

試驗。

8.4鑒定試驗

8.4.1菌種制備

自平板上挑取單菌落，劃線轉接培養于哥倫比亞血瓊脂培養基（3.3）上，36℃±1℃培養48h±2h，

從每一平板中選取至少1個良好分離的特征菌落，轉接保存，進行生化確證試驗。

8.4.2形態觀察

將挑選純化的菌落做革蘭氏染色（3.4）鏡檢。糞腸球菌細胞應為球形，可順鏈的方向延長，直徑

0.5μm～1.0μm，單個、大多數成雙或短鏈狀排列，革蘭氏染色陽性，無芽孢，不染色懸滴或壓滴標本

片下通常不運動。

8.4.3生化鑒定試驗

挑取純化的菌落用麥氏比濁儀調節菌濃至0.5MFC。使用生化鑒定試劑盒、生化鑒定管或者微生物

鑒定儀按說明進行鑒定試驗。生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，如果采用的培養基與本標準確證試驗所用

的培養基一致，可以按照商品說明書使用這些試劑盒或生化鑒定管進行該項確證試驗。如果采用的培養

基與本標準確證試驗所用的培養基一致，可以使用其他鑒定儀器。如微生物鑒定儀也可進行該確證試驗。

糞腸球菌的主要生化特性見表1。

表1糞腸球菌的主要生化特性

菌名半乳糖麥芽糖葡萄糖乳糖棉籽糖甘露醇H2S吲哚甲基紅硝酸鹽

還原

糞腸++++----+-

球菌

8.4.4PCR鑒定試驗

引物：F:5’-TGCCGCATGGCATAAGAG-3’R:5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’。

預計擴增產物大小為1097bp。反應體系見表2。

表2PCR反應體系

——

3

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試劑使用量（uL）

2×PCRMix緩沖液30

上游引物（20μM）1

下游引物（20μM）1

模板（100ng/μL）2

ddH2O適量

總體積50

程序設定如下：①預變性：95℃5min；②變性：95℃45s；③退火：48℃45s；④延伸：72℃45s；

⑤保溫：4℃30min。步驟②至④的循環數設為30。

9檢測結果

9.1計算每塊板上糞腸球菌菌落數

計算每塊平板上的糞腸球菌菌落數a，使用式（1）計算

b

aC………(1)

A

式中：

a——計算每塊平板上的糞腸球菌菌落數；

b——挑取后經證實為糞腸球菌的菌落數；

A——挑取平板上用于驗證的菌落數；

C——平板上的所有特征菌落數

最終結果按照GB/T8170數值修約規則修約至整數。

例如若某平板上有100個典型菌落，取5個鑒定，證實為糞腸球菌的是4個，則：

4

a＝×100＝80

5

9.2樣品中糞腸球菌菌數的計算方法及報告

選擇兩個連續稀釋度平板（每個稀釋度至少有一塊平板，其上經確證后的糞腸球菌菌數介于30～300

之間），通過式（2）計算，即為1mL或1g樣品中的糞腸球菌菌數N：

a

N……(2)

Vn10.1n2d

式中：

N--------樣品中糞腸球菌菌落數；

∑a---------所有平板經確證后的糞腸球菌菌數的總和；

V--------平板的接種體積，單位為毫升（mL）；

n1---------第一個稀釋度的平板數；

n2---------第二個稀釋度的平板數；

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d---------第一個稀釋度的稀釋因子（未經稀釋的液體樣品的d值）。

按GB/T8170執行。將計算出的結果保留至兩位有效數字，也可將樣品的糞腸球菌菌落數記錄為

1.0～9.9乘以10的指數冪表示。

報告每mL或每g樣品的糞腸球菌估計數，單位CFU/g（mL）。

5

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AA

附錄A

（規范性附錄）

培養基和試劑

A.1糞腸球菌培養基

A.1.1成分（g/L）

?胨10.0

麥芽糖20.0

酵母浸粉10.0

甘油磷酸鈉10.0

氯化鈉5.0

乳糖1.0

溴甲酚紫0.015

疊氮鈉0.4

TTC0.1

瓊脂13.0

A.1.2制法

溶解各成分于水中，必要時加熱。調整pH值，使培養基pH值在25℃時為7.2±0.2。煮沸使用。

A.2哥倫比亞瓊脂培養基

A.2.1成分（g/L）

酪蛋白胰酶消化物10.0

心胰酶消化物3.0

玉米淀粉1.0

瓊脂13.0～15.0

肉胃酶消化物5.0

酵母浸出粉5.0

氯化鈉5.0

A.2.2制法

溶解各成分于水中，必要時加熱。調整pH值，使培養基pH值在20℃～25℃時為7.3±0.2。121℃

滅菌15min～20min。

A.3革蘭氏染色

A.3.1結晶紫染色液

A.3.1.1成分

結晶紫1g

95%乙醇20mL

1%草酸銨水溶液80mL

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A.3.1.2制法

將結晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.3.2革蘭氏碘液

A.3.2.1成分

碘1g

碘化鉀2g

蒸餾水300mL

A.3.2.2制法

將碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.3.3沙黃復染液

A.3.3.1成分

沙黃0.25g

95%乙醇10mL

蒸餾水90mL

A.3.3.2制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.3.4染色法

將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染色1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，媒染1min，

水洗，滴加95%乙醇脫色，約30s，水洗；滴加沙黃復染液，復染1min，水洗，