ICS11.100CCSC30ZSMM浙江省數(shù)理醫(yī)學(xué)學(xué)會團體標(biāo)準(zhǔn)T/ZSMM0004—2023免疫組化染色顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法Methodofcalibratingcolorationforimmunohistochemistry2023-12-22發(fā)布 2024-1-22實施浙江數(shù)理醫(yī)學(xué)學(xué)會??發(fā)布T/ZSMM0004T/ZSMM0004—2023PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1縮略語 2試劑和材料 2免疫組化染色操作步驟 3免疫組化染色顯色校準(zhǔn) 4免疫組化染色質(zhì)控數(shù)據(jù)存儲 6附 錄 A （資料性附錄）通用質(zhì)控物技術(shù)原理 7參 考 文 獻 8前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省數(shù)理醫(yī)學(xué)學(xué)會提出并歸口。（武漢T/ZSMM0004T/ZSMM0004—2023PAGEPAGE1免疫組化染色顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了免疫組化染色顯色校準(zhǔn)方法相關(guān)的術(shù)語和定義、縮略語、方法原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、通用質(zhì)控物制備、IHC實驗步驟、免疫組化染色顯色校準(zhǔn)（MCC）和免疫組化染色質(zhì)控數(shù)據(jù)。規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)暫無規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。DABcoloration在免疫組化染色中使用二氨基聯(lián)苯胺顯色底物使標(biāo)記辣根過氧化物酶的抗體經(jīng)過反應(yīng)后產(chǎn)生肉眼可見棕黃色顏色的化學(xué)反應(yīng)。allpurposequalitycontrolobjectAQCO適用于免疫組化染色的系列小鼠、兔、驢蛋白混合物組合，可用于驗證不同的標(biāo)靶點：112233注：通用質(zhì)控物涉及免疫學(xué)技術(shù)創(chuàng)新應(yīng)用，具體原理詳見附錄A。allpurposequalitycontrolslidesAQCS通用質(zhì)控物（3.2）被預(yù)先鋪貼于粘附載玻片上，用蠟?zāi)し獯妫撦d玻片用于任何組織標(biāo)本的免疫組化染色。methodofcalibratingcolorationforIHCMCC在免疫組化染色中使用通用質(zhì)控載玻片（3.3）,依據(jù)給定的操作指南（6.1）來校準(zhǔn)組織標(biāo)本的顯色情況。calibratingcolorationqualitycontroldatafalse-positiveresults分析物為陰性的樣本，檢測結(jié)果為陽性。false-negativeresults分析物為陽性的樣本，檢測結(jié)果為陰性。縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。AQCO:通用質(zhì)控物(AllpurposeQualityControlObject)AQCS:通用質(zhì)控載玻片(AllpurposeQualityControlSlides)IHC:免疫組織化學(xué)染色/免疫組化染色(Immunohistochemistry)MCC:免疫組化染色顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法(MethodofCalibratingColorationforIHC)PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline)試劑和材料通用質(zhì)控物設(shè)計每片免疫組化染色時使用新的通用質(zhì)控載玻片，通用質(zhì)控物和與患者標(biāo)本同步染色。通用質(zhì)控物應(yīng)至少提供陽性、陰性對照功能。通用質(zhì)控物推薦設(shè)置多個（3）1。圖1 通用質(zhì)控物靶點通用質(zhì)控物應(yīng)提供組織標(biāo)本內(nèi)抗原修復(fù)情況、第一抗體效價、第二抗體效價的評估功能，提供有效的質(zhì)控信息。通用質(zhì)控物應(yīng)提供顯色背景顏色亮度值（0～255）的功能，來校準(zhǔn)不同光源條件下觀察結(jié)果產(chǎn)生的差異，以通用質(zhì)控物陰性靶點亮度值=2552。圖2 背景顏色亮度值調(diào)整示意通用質(zhì)控物制備IgG1:1。IgGFcyrⅠ位點制備通用型抗原蛋白混合液。3D3。使用甲醛固定后，石蠟干封。圖3 蛋白混合液梯度比例免疫組化染色試劑小鼠或兔屬第一抗體工作液（EDTA）。抗小鼠、兔的羊?qū)俚诙贵w工作液。牛血清蛋白DonkeyIgGIgG)。5.3.4 PBS（pH=7.2～7.40.05%吐溫-20）。5.3.5 EDTA（501×）。5.36 3%H2。DAB（辣根過氧化物酶型，pH=7.5～7.6）。蘇木素染色液（0.1%）。免疫組化染色操作步驟手工操作裱貼有標(biāo)本組織的通用質(zhì)控載玻片脫蠟至水。常規(guī)抗原熱修復(fù)（97℃）。PBS5min×23min×23%H25mi～10i×1蒸餾水沖洗，PBS5min×2滴加第一抗體工作液（小鼠或兔屬），371h～2h412hPBS5min×310min。PBS5min×3（羊?qū)伲?710min～30min。PBS5min×3DAB3min～5min。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。全自動染色儀操作條件全自動免疫組化染色儀應(yīng)具備熱修復(fù)模塊，且能夠給定的操作步驟（6.1）設(shè)置相同的運行程序。免疫組化染色顯色校準(zhǔn)人工診斷觀察通用質(zhì)控物顯色情況，外觀形態(tài)有無機械性破損，顯色是否正常，正常顯色應(yīng)為梯度深淺的第二抗體顯色與第一抗體顯色以及陰性不顯色（透明）。觀察組織標(biāo)本的顯色情況，外觀有無機械性破損，染色是否清晰。通用質(zhì)控物顯色作為內(nèi)參靶標(biāo)顯色，比對組織標(biāo)本與通用質(zhì)控物的顯色情況，評估、校準(zhǔn)出組4。——若免疫組化顯色結(jié)果為組織無顯色，第二抗體內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱，陰性對照無顯色，第一抗體內(nèi)參無顯色，則判定本次染色過程第一抗體失效，染色質(zhì)量為不合格。——若免疫組化顯色結(jié)果為組織無顯色，第二抗體內(nèi)參、陰性對照、第一抗體內(nèi)參均無顯色，則判定本次染色過程抗原修復(fù)出現(xiàn)問題（完全丟失抗原信息），染色質(zhì)量為不合格。100%濃度靶標(biāo)顯色，陰性對照無顯色，第一抗體內(nèi)參僅高濃度靶標(biāo)顯色，則判定本次染色過程第一抗體、第二抗體均存在效價問題，染色質(zhì)量為不合格。——若免疫組化顯色結(jié)果為組織顯色，第二抗體內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱，陰性對照無顯色，第一抗體內(nèi)參無顯色，則判定本次染色過程出現(xiàn)第一抗體非特異性染色，染色質(zhì)量為不合格。——若免疫組化顯色結(jié)果為組織弱顯色，第二抗體內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱但強度明顯降低，陰性對照無顯色，第一抗體內(nèi)參梯次顯色但強度明顯降低，則判定本次染色過程第一抗體、第二抗體均存在效價損失，染色質(zhì)量為不合格。——若免疫組化顯色結(jié)果為組織弱顯色，第二抗體內(nèi)參無顯色，陰性對照無顯色，第一抗體內(nèi)參梯次顯色但強度明顯降低，則判定本次染色過程抗原修復(fù)出現(xiàn)問題（丟失大部分抗原信息）、第二抗體均存在效價損失，染色質(zhì)量為不合格。——若免疫組化顯色結(jié)果為組織顯色，第二抗體內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱，陰性對照無顯色，第一抗體內(nèi)參梯次顯色，則判定本次染色過程正常，染色質(zhì)量為合格。圖4 人工判讀指南人工智能輔助診斷使用數(shù)字病理玻片掃描儀將待分析的免疫組化染色玻片掃描為數(shù)字圖像，圖像內(nèi)容應(yīng)包括組織5。圖5 通用質(zhì)控載玻片掃描范圍根據(jù)通用質(zhì)控物提供的顯色背景顏色亮度值（0～255），將數(shù)字圖像的背景顏色校準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)光源下產(chǎn)生的正確顯色，以通用質(zhì)控物陰性靶點亮度值=2556。圖6 顯色背景顏色亮度調(diào)節(jié)指示根據(jù)通用質(zhì)控物提供的抗原濃度信息和對應(yīng)的顯色程度作為參考，計算組織標(biāo)本的相對光密度與相對抗原濃度，有效評估組織標(biāo)本內(nèi)真實的抗原情況。免疫組化染色質(zhì)控數(shù)據(jù)存儲免疫組化染色質(zhì)控數(shù)據(jù)的儲存信息應(yīng)包括但不限于：標(biāo)本基礎(chǔ)信息：門診號、病理號、患者姓名、患者年齡、患者性別、患者聯(lián)系方式、臨床診斷、既往史、取材部位；單位基礎(chǔ)信息：醫(yī)院名稱、送檢科室、送檢醫(yī)生、聯(lián)系方式；標(biāo)本接收時間、IHC試劑耗材品牌型號、批次、批號；手工染色或免疫組化自動染色機信息；第一抗體、第二抗體有效濃度驗證記錄；抗原修復(fù)結(jié)果評估；（合格/不合格）第一抗體效價評估；（合格/不合格）第二抗體效價評估；（合格/不合格）顯色質(zhì)量評價。（合格/不合格）通用質(zhì)控物技術(shù)原理

附 錄 A（資料性附錄）該類蛋白混合物（小鼠、兔）與通用型羊?qū)俚诙贵w發(fā)生特異性結(jié)合，無法與小鼠、兔屬第一抗體發(fā)生結(jié)合。該類蛋白混合物由1