第二節基因工程的基本操作程序人教版高中生物學教材《生物技術與工程》（選擇性必修三）第三章問題探討蘇云金桿菌培育轉基因抗蟲棉需要哪幾步？Bt基因表達蘇云金伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）攝食害蟲死亡蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因導入Bt基因重組DNA分子培育轉基因抗蟲棉的簡要過程問題探討基因工程的基本操作程序（4個步驟）1234目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取一、目的基因（1）概念：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因；與生物抗逆性、優良品質、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因。（Bt抗蟲蛋白基因：轉基因抗蟲棉）。主要是編碼特定蛋白質的基因（2）實例：目的基因的篩選與獲取二、篩選合適的目的基因方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選。DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對美國國家生物信息中心越來越多基因的功能和結構被分析。PCR技術：PCR是__________________的縮寫，是一項根據________________的原理，在______提供參與DNA復制的__________與____________，對_______________________進行___________的技術；聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外各種組分反應條件目的基因的核苷酸序列大量復制全稱聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復制特異性地快速擴增目的基因原理操作環境目的優點：目的基因的篩選與獲取三、目的基因的獲取DNA復制所需的基本條件:參與的組分在DNA復制中的作用

解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）（2種）引物是一小段能與__________的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物子鏈延伸子鏈延伸PCR條件耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA模板引物（2種）穩定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶PCR條件3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性當溫度上升到90℃以上時,雙鏈DNA解聚為單鏈B.復性當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合C.延伸當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’PCR過程5’3’5’5’第一次循環第二次循環3’5’第三次循環3’3’思考：

1.PCR技術獲取目的基因時至少要經過幾次循環才能從DNA分子中分離出目的基因？PCR過程思考：2.PCR技術最終哪部分被大量復制了？引物對之間的部分3’5’5’3’5’5’3’3’思考：3.PCR引物設計應遵循哪些原則？引物自身及引物之間不應存在互補序列等思考：4.一個DNA，一對引物（A與B），通過PCR擴增n次：

復制過程中共需引物__________個2n＋1-2PCR過程基因表達載體的構建一、基因表達載體的目的（1）？（2）？二、基因表達載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質。基因的上游（一段有特殊結構的DNA片段）人們所需要的基因位置：功能：基因的下游（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉錄用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細胞基因表達載體的構建三、基因表達載體的構建過程基因表達載體構建模式圖載體（質粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種培育抗蟲棉的簡要過程使用一種DNA限制酶進行切割，共有幾種連接情況？問題探討選擇用2種不同的限制酶同時對目的基因和質粒切割，減少自身環化的情況。載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1培育抗蟲棉的簡要過程

閱讀81-82頁，思考下列問題：1.將目的基因導入受體細胞時分別采用哪些方法？①植物細胞②動物細胞②微生物細胞2.目的基因的檢測與鑒定包括哪些水平的鑒定？具體做法分別是？將目的基因導入受體細胞的方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——Ca2+轉化法顯微注射法（1）花粉管通道法（我國科學家獨創）方法2：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物1.目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法1.目的基因導入植物細胞1.什么是轉化？2.農桿菌轉化法利用了農桿菌哪些特點。3.農桿菌轉化法中涉及到幾次DNA的拼接和幾次導入？（可轉移的DNA）關于農桿菌培育抗蟲棉的簡要過程

閱讀81-82頁，思考下列問題：1.將目的基因導入受體細胞時分別采用哪些方法？①植物細胞②動物細胞②微生物細胞2.目的基因的檢測與鑒定包括哪些水平的鑒定？具體做法分別是？1.基因工程的基本操作程序（4個步驟）,核心步驟？2.利用基因工程的培育抗蟲棉，抗蟲基因來自于？3.篩選目的基因較為有效的方法是？人們通過哪些技術研究基因的結構和功能？4.PCR的全稱、原理、操作環境、優點、條件分別是？5.PCR每次循環分為哪3步？對應溫度及具體過程分別是？鑒定PCR產物的技術是？6.構建基因表達載體的2個目的？7.基因表達載體必須包含哪些結構？啟動子、終止子的位置和功能分別是？8.怎樣避免質粒和目的基因的自身環化？9.將目的基因導入植物細胞的方法有哪些？10.花粉管通道法的兩種操作分別是？11.轉化的概念？農桿菌轉化法利用了農桿菌的哪些特點？整個過程進行了幾次DNA的拼接？幾次導入？12.將目的基因導入動物細胞、原核生物的具體方法分別是？13.在分子水平對目的基因檢測與鑒定的方法有哪些？還需要進行什么水平的鑒定？14.PCR的原理？步驟？離心的目的？預變性的目的？15.鑒定PCR產物的方法？鑒定原理？加樣時，留兩個孔，分別加入什么物質？分別有什么目的？16.怎樣避免外來DNA的污染？緩沖液和酶怎樣保存？怎樣解凍？第二節基因工程的基本操作程序2人教版高中生物學教材《生物技術與工程》（選擇性必修三）第三章探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經歷___次循環；熱變性調節溫度自動調控溫度30②PCR擴增DNA片段還利用了______________的原理；DNA半保留復制變性90?C延伸72?C復性50?C2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在_____的作用下，這些________會向著________________的電極移動，這個過程就是_____；可解離的基團pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的______下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構象DNA片段的擴增及電泳鑒定在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。凝膠電泳原理示意圖二、材料用具①PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）DNA片段的擴增及電泳鑒定一次性吸液槍頭10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。(離心管)⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等二、材料用具DNA片段的擴增及電泳鑒定注：模板DNA的用量為1pg-1ug使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結合三、方法步驟DNA片段的擴增用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1minDNA片段的擴增及電泳鑒定PCR技術移液離心擴增DNA片段的電泳鑒定

根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻①將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜②待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。三、方法步驟DNA片段的擴增及電泳鑒定配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠

將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物

接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相DNA片段的電泳鑒定三、方法步驟DNA片段的擴增及電泳鑒定加樣電泳觀察1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。特別注意DNA片段的擴增及電泳鑒定四、結果分析與評價1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。

如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。DNA片段的擴增及電泳鑒定第二節基因工程的基本操作程序3人教版高中生物學教材《生物技術與工程》（選擇性必修三）第三章實驗：DNA片段的擴增及電泳鑒定PCR儀DNA分子電泳1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經歷___次循環；熱變性調節溫度自動調控溫度30②PCR擴增DNA片段還利用了______________的原理；DNA半保留復制變性90?C延伸72?C復性50?C2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在_____的作用下，這些________會向著________________的電極移動，這個過程就是_____；可解離的基團pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關③凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的______下被檢測出來。凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構象凝膠電泳原理示意圖1.儀器2.材料PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等微量離心管微量移液器電泳裝置PCR儀10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL3.PCR反應體系的配方注：模板DNA的用量為1pg-1ug使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結合用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min移液離心擴增1.DNA片段的擴增配制瓊脂糖溶液根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物電泳接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相2.DNA片段的電泳鑒定2.DNA片段的電泳鑒定1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。注意1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。

如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。

如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；轉Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因？新冠病毒核酸檢測

(2022·天津一中高二期中)下