實驗十二DNA的銜接與轉化

1.ＤＮＡ分子的體外銜接2．ＤＮＡ的轉化及轉化子的挑選一．實驗目的及背景

當我們曾經獲得目的基因片段，選擇好適當的克隆〔或表達，轉化〕質粒載體，并確定重組方案后，下面要進展的就是ＤＮＡ片段之間的體外銜接，從而獲得重組子。此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達〔如現代基因工程藥物的消費〕，還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研討中。1、ＤＮＡ分子的體外銜接

ＤＮＡ分子的體外銜接就是在一定條件下，由ＤＮＡ銜接酶催化兩個雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間構成磷酸酸脂鍵的生物化學過程，ＤＮＡ分子的銜接是在酶切反響獲得同種酶互補序列根底上進展的。銜接反響中值得留意的幾個問題：1.ＤＮＡ銜接酶常用的ＤＮＡ銜接酶有兩種：(1)來自大腸桿菌的ＤＮＡ銜接酶(2)來自噬菌體的Ｔ４ＤＮＡ銜接酶。二者的作用機理類似。Ｔ４ＤＮＡ銜接酶作用機制Ｔ４銜接酶作用分三步：１．Ｔ４ＤＮＡ銜接酶與輔助因子ＡＴＰ構成酶－ＡＭＰ復合物。２．酶－ＡＭＰ復合物結合到具有５’－磷酸基和３’－羥基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。３．產生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.2.銜接反響的溫度ＤＮＡ銜接酶的最適反響溫度為３７℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結合很不穩定，折衷方法是１２℃過夜。3.DNA的平未端和粘性末端由于內切酶產生的DNA末端有平未端和粘性末端，因此銜接反響中就有平未端銜接和粘性末端銜接。二者銜接效率不同。粘性末端效率高，因此在底物濃度，酶濃度選擇上是有差別的，4.堿性磷酸酶處置質粒載體為了提高銜接效率，普通采取提高ＤＮＡ的濃度，添加重組子比例。這樣就會出現ＤＮＡ自生銜接問題，為此通常選擇對質粒載體用堿性磷酸酶處置，除去其５’末端的磷酸基，防止環化，經過接反響后構成的缺口可在轉化細胞后得以修復。見以下圖。5.銜接反響的檢測銜接反響勝利與否，最后的檢測要經過下一步實驗，轉化宿主菌，陽性克隆的挑選來確定。我們下面的實驗從粘性末端為例操作。二、實驗試劑１．純化后的酶切質粒載體和目的基因。２．１０×Ｔ４ＤＮＡ銜接酶buffer200mMTris-HCl(pH7.6)50mMMgCl250mM二硫芐糖醇500μl/mlBSA３．Ｔ４ＤＮＡ銜接酶４．5mMATP三．實驗方法

ＤＮＡ分子的體外銜接１．在無菌Eppendorf管中參與以下溶液：a.0.1μg質粒載體，２倍分子的外源ＤＮＡ。b.加無菌水至7.5μl，于４５℃加溫５分鐘使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。c.參與：１０×Ｔ４ＤＮＡ銜接酶buffer1μlＴ４ＤＮＡ銜接酶0.1Weiss5mMATP1μl２．蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心５秒。３．１２℃下過夜銜接反響。４．反響終了后于－２０℃保管。四．結果與分析

電泳檢查銜接結果１．如何判別銜接效果的勝利性？問題與討論：１．簡述Ｔ４ＤＮＡ銜接酶作用機理。２．簡述一個完好外源ＤＮＡ的克隆過程。３．銜接反響中應留意些什么問題及如何提高銜接效率。2．ＤＮＡ的轉化及轉化子的挑選

一．實驗目的及背景體外經過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質粒，選用轉化和挑選技術，可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，ＤＮＡ可在生物體系中大量擴增，繁衍，保管以及表達目的基因的產物，這是ＰＣＲ體外擴增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重組技術，所獲得的，不同目的需求的陽性菌株已廣泛運用于科研，醫藥消費和生物發酵等領域。本實驗由二個方面組成:1.質粒ＤＮＡ轉化大腸桿菌。質粒轉化不同細菌有不同的轉化效率，轉化效率的高低與實驗的成敗直接相關，通常轉化效率可達１０５－１０７轉化子/μgDNA。獲得高轉化效率的關鍵是感受態體菌的制備。所謂感受態，就是細菌吸收轉化因子的生理形狀。關于感受態的本質與存在，說法很多，目前主要有兩種假說：１．部分原生質體化假說－－感受態細胞的外表構成一種能接受ＤＮＡ的酶位點，使ＤＮＡ分子能進入細胞。制備感受態細胞如今制備感受態細胞通常用CaCl2處置，在低溫中與外來ＤＮＡ分子相混合.ＤＮＡ分子轉化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌外表；２．轉入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解；３．自穩－－外源質粒ＤＮＡ分子在細胞內復制成雙鏈；４．表達一供體基因伴隨復制子同時復制，分裂，轉錄翻譯。2.重組子的挑選這和受體菌：質粒ＤＮＡ的選擇相關，原那么上要留意：１．受體菌必需是限制與修飾系統缺陷的菌株；２．根據質粒基因型和受體菌基因型互補原那么而定。重組子的挑選方法常用的有兩種方法：１．抗生素挑選法菌株為某種抗生缺陷型，而質粒上帶有該抗性基因〔如氨芐青霉素，卡拉霉素等〕這樣只需轉化子才干在含該抗生素的培育基上長出。本實驗利用抗生挑選轉化子。２互補法如今運用的許多載體〔如ＰＵＣ系列〕有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區段，其中含有β－半乳糖苷酸基因〔lacZ〕的調控序列和頭１４６個氨基酸偏碼區。這個偏碼區中插入一個多克隆位點。受體菌那么含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有β－半乳糖苷酶表達，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷〔x-gal〕培育基中構成蘭色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而呵斥插入失活，而使lacZ基因不表達而構成白色菌斑。經過顏色不同而區分重組子和非重組子。二、實驗試劑

ＬＢ培育基質粒ＤＮＡ〔含Amp抗生基因〕，受體菌CaCl20.1MAmp三．實驗方法一、感受態細胞制備１．將宿主菌在瓊脂培育基平板上劃線，３７℃培育１６～２０小時。２．挑取單菌落轉入２０ｍｌＬＢ培育基錐瓶中，３７℃振蕩過夜。３．從中取２ｍｌ菌液轉入５０ｍｌＬＢ培育基中３７℃振蕩培育４－５小時，測ＯＤ１００達０．４～０．５。４．培育物于冰上１０分鐘。５．轉入－５０ｍｌ離心管，于４０００ｒｐｍ下４℃離心１０分鐘。６．棄上清，倒置離心管１分鐘，流盡剩余殘液然后參與10ml用冰預冷的0.1mol/LCaCl2，置冰上１０分鐘。７．4,000rpm4℃離心１０分鐘，棄上清。８．參與2ml，0.1MCaCl2懸浮細胞，于４℃過夜。二、轉化

１．在1.5mlEppendorf管中參與２００μl感受態細胞和１０μl40ngDNA溶液，溫暖混勻，于冰上３０分鐘。２．于４２℃水浴９０秒。３．冰浴２分鐘。４．參與８００μlＬＢ液體培