土壤反硝化對磺胺嘧啶及抗性基因消減的影響劉款；A.PaulSchwab;孫明明;劉滿強;焦加國;田達;陳旭;武俊;李輝信;胡鋒【摘要】Mixedcontaminationwithantibioticsandantibioticresistancegenes(ARGs)infarmlandsoilhasbecomeanemergingthreatagainsthumanhealthandenvironmentalsecurity.However,littleattentionhasbeenpaidontheimpactofanoxicdenitrificationonthedissipationofsoilantibioticsandARGs.Therefore,thepresentworkcollectedthesubsurfacemixed-contaminatedarablesoilarounddairyfarm,andinvestigatedtheinfluenceofdenitrificationprocessonthedissipationofsoilsulfonamidesandtheircorrelatedARGs.Theresultsindicatedthatnitrateadditiontothesoilclearlyimprovedthenitratetransformingrateinbothsoilandwaterphases,theN2Oproduction,andthedissipationofsoilsulfonamidesandARGabundance.Inaddition,theclearlynegativecorrelationbetweentheabundancedenitrifyinggenes(nirK,nirS,andnosZ)andsulfonamideresistancegenes(sulIandsulII)demonstratedthatmoresufficientthenitratenitrogen,thestrongertheexpressofdenitrifyinggenesandthestrongerthedenitrificationprocess;inordertopromotethesulfonamide/ARGdissipation.Moreover,throughhigh-throughputsequencingandtheexperimentoftheseparationofdenitrifyingbacteria,ProteobacteriaLysinibacilluswerethepredominantstrainsisolatedfromanoxicsoilamongvarioustreatments,whichlikelyplayedanimportantroleinpromptingdenitrifyingprocedureandstimulatingsulfonamide/ARGdissipation.ThisworkprovidednovelinformationontheanoxicdissipationofsoilantibioticsandtheARGproliferation.%農田土壤中抗生素及抗性基因的復合污染已給生態環境安全和人體健康帶來了全新隱患.針對厭氧條件下,反硝化作用過程對土壤抗生素乃至抗性基因消減影響的研究一直相對較少.因而，本研究采集牛糞堆積池塘周邊底層農田土壤作為目標污染土壤，重點研究反硝化作用過程對土壤磺胺嘧啶及抗性基因消減動態的影響結果表明:相較于原始污染土壤處理(T1),添加了NO-3-N的處理(T2)可以顯著強化土壤和水相中反硝化速率，提升N2O的產氣速率,促進土壤中磺胺嘧啶濃度和抗性基因豐度的快速降低；同時發現土壤反硝化基因(nirK、nirS和nosZ)與磺胺類抗性基因(sulI和sulII)呈顯著負相關(P<0.05),說明當NO-3-N底物越充足，土壤反硝化細菌活性往往被激活，其反硝化功能基因表達就越活躍，土壤反硝化作用過程就越強烈，從而反饋作用促進磺胺嘧啶抗生素的厭氧消減，進而有助于sul系列抗性基因豐度的顯著衰減;同時通過高通量測序技術及對反硝化細菌的分離篩選后，發現變形菌門(Proteobacteria)賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)的細菌是土壤厭氧反應前后的主導優勢菌群，對于強化反硝化過程和促進磺胺嘧啶及sul抗性基因的消減發揮了潛在的積極作用.本研究結果可為探明土壤中抗生素的厭氧消減過程和緩解抗性基因的擴散傳播提供新穎的認知基礎.【期刊名稱】《土壤》【年(卷)，期】2017(049)003【總頁數】10頁(P482-491)【關鍵詞】厭氧反硝化;磺胺嘧啶;反硝化基因;抗性基因【作者】劉款;A.PaulSchwab;孫明明;劉滿強;焦加國;田達;陳旭;武俊;李輝信;胡鋒【作者單位】南京農業大學資源與環境科學學院浦京210095;美國德州農工大學土壤與作物科學系，德克薩斯州大學城77843-2474浦京農業大學資源與環境科學學院浦京210095;中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所)，南京210008;南京農業大學資源與環境科學學院，南京210095;江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心，南京210095浦京農業大學資源與環境科學學院，南京210095;江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心，南京210095;南京農業大學資源與環境科學學院，南京210095浦京農業大學資源與環境科學學院，南京210095浦京農業大學資源與環境科學學院，南京210095浦京農業大學資源與環境科學學院，南京210095;南京農業大學資源與環境科學學院，南京210095【正文語種】中文［中圖分類】X53抗生素(antibiotics)是由微生物(包括細菌、真菌、放線菌)產生的一類具有顯著抑制或殺滅其他類型微生物生長或生存的代謝產物［1-2］。近年來為了進行預防大規模畜禽疾病的爆發和保障畜禽的產量及健康，大量獸用抗生素藥物常作為抗菌劑和促生長劑，被廣泛應用于畜牧養殖業的全生產過程［3-4］，但由于畜禽往往難以在短期內將體內抗生素獸藥完全代謝吸收，因而含有抗生素母體化合物或次生代謝產物的畜禽糞便常作為有機肥，被長期反復地施入農田土壤環境，并逐漸誘導和篩選出大量抗生素抗性細菌(antibioticresistancebacteria，ARB)［5］，從而致使ARB體內抗生素抗性基因(antibioticresistancegenes，ARGs)豐度的過量異常表達，進而可以通過食物鏈的傳遞和積累作用，對人體健康和環境安全帶來了較為嚴重的生態風險［6］。因而，ARGs作為一種新型的環境大分子生物污染物已受到學術界越來越多的關注［7］。尤其是前期研究表明土壤介質是ARGs的巨大貯藏庫，在影響抗性基因漂移、擴散和傳播的過程中扮演了重要的媒介作用［8-9］。目前，在好氧條件下，國內夕卜學者針對土壤中抗生素的自然消減過程或應用特殊功能微生物菌群強化消減抗生素的研究已有較多報道［10-12］,但由于厭氧環境中土壤抗生素的微生物消減難度較大，所以國內夕卜相關研究進展相對緩慢［13］。同時在實際的自然條件下廣泛存在著被抗生素污染的厭氧環境，如城市河道或污水處理廠底泥、淹水水稻土和底層土壤等在廣義上都屬于較為厭氧的環境［14］。孫明明等［15］在前期研究中發現，反硝化過程有助于促進土壤中非極性有機污染物多環芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)的厭氧消減，在此厭氧反應體系中，NO-3-N作為替代氧氣的電子受體或激發厭氧微生物活性的共代謝底物有效促進了作為電子供體的PAHs被厭氧消減。土壤氮素循環重硝化和反硝化作用是重要的反應過程，而反硝化細菌是反硝化過程中起驅動作用的一類微生物，可促進NO-3-N還原成N2。但針對實際的污染土壤，反硝化過程能否促進土壤中抗生素的微生物厭氧消減，非常值得深入研究。尤其是在電子鏈傳遞的厭氧反硝化作用和抗生素消減作用的耦合過程中，土壤反硝化基因(denitrifyingfunctionalgenes,DNGs)和ARGs的豐度表達存在怎樣的交互影響，同樣值得進一步探明。因此，本研究基于前期南京城郊奶牛場附近，污染農田土壤中抗生素及抗性基因調查的結果［16-17］,采集牛糞堆積池塘周邊的底層農田土壤作為目標污染土壤。以磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)作為典型抗生素污染物代表，采用實驗室模擬培養的方式，在厭氧培養箱中，淹水土壤條件下，重點開展土壤反硝化作用中氮素的轉化過程對SD消減動態的影響，同時分析反硝化基因與抗性基因的交互作用及耦合關聯性，并闡明反應前后關鍵反硝化細菌群落組成結構的特征變化。本研究結果可為探明土壤中抗生素的厭氧消減過程和緩解抗性基因的擴散傳播風險提供科學的認知基礎。1.1供試材料1.1.1供試土壤采自南京城郊某奶牛場附近(32°30'45"N,118°94'7"E)，牛糞堆積池塘周邊的底層磺胺類抗生素污染農田土壤，采用五點取樣法取0~10cm牛糞堆積池塘周邊的土壤共1kg，并混勻，存儲于4C冰箱；試驗前，將采集的土樣風干磨細，過2mm孔徑篩后于陰處室溫保存。測定土樣基本理化性質：pH7.83，全氮1.83g/kg，全磷1.05g/kg，全鉀17.94g/kg。1.1.2試驗試劑分析純鹽酸鹽/EDTA緩沖液、硫酸鎂/氨水(試驗前配置)、甲醇、甲酸、氯化鈣溶液、Mcllvaine緩沖液，具體配置方法參考Awad等［18］的實驗方法。磺胺嘧啶標準溶液：準確稱取SD標準物質，用甲醇配成100mg/L的標準儲備液，-20C避光保存。從上述儲備液中準確吸取0.1ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容，配成1.0mg/L的標準溶液，并用甲醇稀釋配置成6~600凹/L標準工作液，4C避光保存。培養基：LB培養基(g/L):10g胰蛋白腺、5g酵母提取物、10gNaCl、15g瓊脂糖，去離子水定容至1000ml,pH7.0~7.2;漠酚藍(bromothymolblue,BTB)半固定培養基［19］:1gL-天冬酰胺、1gKNO3、1gKH2PO4、0.05gFeCl2?6H2O、0.2gCaCl2?2H2O、1gMgSO4?7H2O、1mlBTB漠酚藍(1%酒精)、5g瓊脂糖，去離子水定容至1000ml,pH7.0~7.3。PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成，DNA基因組提取試劑盒購自美國MP公司，DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自杭州愛思進生物技術公司，TiangenDNA試劑盒購自天根生化科技有限公司。1.1.3儀器設備NO-3-N的分析采用德國布朗盧比3-AA3AutoAnalyzer連續流動化學分析儀；氧化亞氮(N2O)的分析采用Agilent7890A氣相色譜儀；磺胺嘧啶(SD)的分析采用Agilent1290/6460HPLC/MS/MS高效液相色譜-串聯四極桿質譜；樣品冷凍干燥采用SigmaChrist高速冷凍離心機；反硝化基因及抗生素抗性基因的豐度分析采用AppliedBiosystemsStepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀。1.2試驗方法1.2.1試驗處理試驗設置兩個處理：T1:原始SD污染農田土壤；T2:原始SD污染農田土壤+20mg/kgNO-3-N。每個處理重復3次，選用250ml棕色瓶培養，每個培養瓶中添加100g土壤及120ml水，置于厭氧培養箱中常溫培養60天，分別在第1、3、7、15、23、60天進行破壞性采樣。采集水樣及土樣置于4C避光保存。NO-3-N及N2O測定土壤NO-3-N含量：水土比5:1,2mol/LKCl浸提后用流動分析儀測定；水相NO-3-N含量：過濾后用流動分析儀測定。N2O的測定：試驗開始放入厭氧培養箱前，打開橡膠塞，向瓶內通高純氮氣，使瓶內的CH4、N2O、CO2、NO等排出并保持厭氧培養環境，分別在1、6、12、24、72、168、345h各采樣一次，用10ml注射性針筒采集氣體樣品，氣相色譜儀測定N2O樣品濃度。土壤中磺胺類抗生素測定樣品前處理：稱取2.0g土壤樣品于50ml棕色玻璃離心瓶中，加入鹽酸鹽/EDTA緩沖液15ml、硝酸酶/氨水混合溶液5ml,渦旋1min，超聲提取15min,5000r/min離心10min，收集上清液。再按照上述方法重復提取2次，合并提取液，用濾膜(0.45pm)過濾后超純水稀釋至500ml。固相萃取時，預先用10ml甲醇和10ml超純水對HLB固相萃取柱進行活化，然后使提取液以3~5ml/min的流速上柱，進行萃取富集。富集完畢后，用10ml超純水淋洗小柱，并用氮氣吹干20min，除去柱中殘留水分，之后用含0.1%甲酸的甲醇溶液進行洗脫，收集的洗脫液在氮吹儀上吹至近干，再用含0.1%甲酸的甲醇溶液定容至1ml，渦旋混勻后經0.22pm針式濾器過濾至2ml棕色小樣瓶中，避光，-5C，待測。4種形態SD提取。樣品前處理：稱取2.0g土壤樣品于50ml棕色玻璃離心瓶中，加入超純水15ml，渦旋1min，超聲提取15min,5000r/min離心10min,收集上清液，獲得水溶態SD；再向離心后土壤中加入0.1mol/LCaCl2溶液15ml，渦旋1min，超聲提取15min，5000r/min離心10min，收集上清液，獲得可交換態SD；隨后再向離心后土壤中加入Mcllvaine緩沖液（1000ml0.1mol/L檸檬酸溶液與625ml0.1mol/L磷酸氫二鈉）15ml，超聲提取15min，5000r/min離心10min，收集上清液，獲得松散結合態SD；最后向剩余土壤加入磷酸鹽/EDTA緩沖液15ml，硝酸酶/氨水混合溶液5ml，渦旋1min，超聲提取15min，5000r/min離心10min，收集上清液，獲得緊密結合態SD。SD純化富集方法同上。土壤中反硝化基因及抗生素抗性基因測定用FastDNA試劑盒提取土壤DNA，用微量分光光度計NanoDrop測定提取的土壤DNA的純度（OD260/OD280在1.8~2.0之間）和濃度。PCR檢測6種基因，包括3種反硝化基因nirK、nirS、nosZ，兩種磺胺類抗性基因sulI、sulII，及一型整合子IntI1，相關引物序列及PCR擴增條件在表1展示。采用PCR擴增后的產物，用DNA凝膠純化回收試劑盒（AxyPrepDNAGel）純化目的基因片段，將片斷連接在pMDTM19-T載體，利用感受態大腸桿菌細胞（Trans5a）進行轉化。在帶有其他抗生素的平板上涂布后挑選陽性克隆子，用LB液體培養基進行擴大培養（約6ml）,取2ml菌液送公司測序插入基因片段，剩余約4ml菌液用來提取質粒，稀釋標線備用，并用NanoDrop測定質粒濃度用以后續計算。用絕對定量進行反硝化基因及抗生素抗性基因豐度的測定，定量PCR反應在StepOnePlusTMRealTimePCRsystem儀器上進行。土壤中反硝化細菌分離及鑒定將添加NO-3-N的土壤以水土比5:1的懸濁液澄清后，取100Ml上清液涂在LB培養基上，置于30^培養箱中的厭氧培養袋中培養，7天后，從平板中挑選出的單菌落轉接到BTB半固體培養基中，并置于30OC培養箱中，7~10天后，篩選出產生氣泡同時變藍的試管，挑選菌落接種至3mlLB液體37°C培養8h,用Tiangen試劑盒提取細菌DNA，進行PCR定性判斷及測序鑒定。1.2.6高通量測序針對第1天及第60天的土壤樣本所提取的DNA，利用通用引物319F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')擴增其中土壤細菌的16srDNA基因的V3、V4區域，擴增完成后的PCR產物使用beads純化后利用杭州聯川生物技術有限公司的Illumina測序儀上機測序。1.3數據分析所用數據為3次重復采樣的平均值，利用軟件OriginPro8.5和SPSS21進行數據統計分析。圖表采用MicrosoftExcel2013和軟件OriginPro8.5繪制。2.1土壤厭氧反硝化作用的動態變化過程由于本研究中使用的土壤樣品采集自奶牛場牛糞堆積池附近的底層土壤，其中氮素的本底含量較高，因此不同處理樣品土壤中反硝化過程可能是氮素厭氧轉化的主要途徑之一［20］。從圖1可知，在60天的厭氧培養過程中，不同處理條件下土壤和水相中NO-3-N濃度呈現先迅速降低再緩慢消減的趨勢。T1和T2處理下土壤和水相中NO-3-N含量在最初的7天內迅速降低(圖1A、1B),土壤中分別由初始NO-3-N含量7.3mg/kg和24.3mg/kg下降至第7天的1.6mg/kg和1.9mg/kg，水相中分別由初始NO-3-N含量3.3mg/kg和5.5mg/kg下降至第7天的1.1mg/kg和0.9mg/kg，隨后的培養時間內(第7~23天)土壤和水相中NO-3-N含量消減速率逐漸變緩。此外，添加NO-3-N的T2處理其N2O氣體的產氣速率顯著高于原始污染土壤T1處理(圖1C,P<0.01),并且在第12h達到積累最高值0知g/(g?h)，隨后N2O氣體的累積濃度逐漸消減，同時在第72h的取樣時間點接近消減完畢。而T1處理中N2O氣體的產氣積累量在72h才達到最高積累值0.7pg/(g-h)，在隨后的350h內逐漸消減完畢。圖1結果顯示出添加NO-3-N底物，有助于激活土壤中厭氧反硝化作用的速率和進程，為模擬和營造強化的反硝化作用過程體系提供了活躍的反應條件。2.2反硝化功能基因豐度的動態變化過程在微生物介導的土壤厭氧反硝化過程中，反硝化功能基因的豐度變化是決定反硝化速率和進程的關鍵要素。如公式(1)所示［21］，不同的反硝化作用環節是受到了不同特征反硝化功能基因豐度變化的影響［22］。在本研究中，選取了豐度表達穩定且具有限速作用的關鍵反硝化功能基因進行絕對豐度動態變化的測定分析［23］。即：由硝酸鹽向亞硝酸鹽轉化的還原酶編碼基因nirS和nirK，以及由N2O氣體向N2轉化的還原酶編碼基因nosZ基因。由圖2可知，不同處理中反硝化基因絕對豐度均出現先上升后下降的趨勢，尤其是在不同培養時間內，T2處理中nirK、nirS和nosZ基因豐度顯著高于T1處理中相關反硝化基因豐度(P<0.01)。T2處理中nirK與nirS基因在第15天分別達到最高值6.63x106和5.45x106copies/g(圖2A,2B),nosZ基因在第23天達到最高值7.30x105copies/g(圖2C)。該部分數據說明原始污染土壤中即存在特定豐度的反硝化功能細菌，當外界人為添加硝態鹽底物后，土著反硝化細菌的代謝活性得到顯著激活和促進，進而反硝化功能基因豐度的維持和增長也得到迅速強化，這與圖1中NO-3-N的快速消減動態過程相呼應一致，隨后伴隨著NO-3-N、NO-3-N底物及N2O氣體積累濃度的消減，nirK、nirS和nosZ基因豐度也在培養的后期逐漸衰減并趨于穩定。2.3土壤中磺胺嘧啶厭氧消減的動態變化土壤中抗生素在好養或厭氧條件下，往往都存在物化和微生物聯合作用下的水解、轉化或降解等自然消減過程［24-26］。在本研究中，不同處理下，土壤中磺胺嘧啶(SD)在60天的厭氧培養周期內也出現了顯著的消減過程。由圖3A所示，人為添加了NO-3-N的處理（T2處理）中SD的厭氧消減速率和程度都顯著大于原始的污染土壤（T1處理）。土壤中SD的濃度由初始值550.2pg/ml分別消減至第60天的286.2pg/ml（T1處理）和196.4pg/ml（T2處理）；該結果說明強化了的反硝化作用有助于土壤中SD的厭氧消減。這可能是由于在該厭氧反應體系中NO-3-N底物作為電子受體被還原，而SD作為電子供體被氧化，當體系中NO-3-N底物供給充足時，更加有利于電子鏈的傳遞過程，進而促進SD的消減。此外，在厭氧消減過程中，土壤中抗生素的賦存形態也同樣值得關注。由于不同的賦存形態具有不同的環境遷移行為，不同的環境遷移行為又會顯著影響抗生素的生物可汲性以及對土著細菌抗性誘導的脅迫壓力。因而在本研究中，我們將土壤中抗生素劃分為水溶態、可交換態、松散結合態及緊密結合態4種主要賦存形態，其中水溶態抗生素是生物可汲性相對較高的組分，其對土著細菌的抗性篩選具有持續的選擇壓力［27］。而且反硝化作用有助于促進松散結合態和緊密結合態SD的消減，更有助于抗生素對土著細菌的脅迫壓力。由圖3B可知，盡管不同處理下，土壤SD濃度都出現顯著的下降，但是在第60天時，T1處理下土壤中水溶態SD的濃度是90.2pg/ml,顯著高于T2處理下土壤中水溶態SD的濃度68.3pg/ml,說明反硝化作用有利于生物可汲性較高組分的抗生素深度消減，對于緩解抗生素對土著細菌的直接誘導壓力具有積極的作用。2.4土壤中磺胺類抗性基因豐度厭氧波動變化抗生素獸藥的濫用會誘導出大量含有ARGs的抗性細菌顯現，前人研究表明部分攜帶ARGs的細菌死亡之后，其ARGs仍然能釋放到環境中或者通過基因水平轉移的方式進入到其他微生物體內［28-29］,從而增加了ARGs擴散傳播的風險。因而，對土壤中磺胺類抗性基因豐度厭氧波動變化的監測也是本研究重點關注的內容之一。從圖4可知，sull和sulII的豐度在厭氧條件下隨著培養時間的延長而逐漸降低。T2處理條件下，sull和sulII豐度在培養前后顯著下降了近2個數量級，分別由初始的3.41x106.1.57x106copies/g下降至第60天的9.20x104、2.46x104copies/g;然而T1處理條件下，sulI和sulII豐度僅分別由初始的3.20x106.1.50x106copies/g下降至第60天的6.69x105.2.91x105copies/g，說明強化后的反硝化作用也有助于土壤中磺胺類抗性基因的厭氧消減。添加NO-3-N促進了SD的消減，同時抗生素又是抗性基因豐度的選擇壓力之一,SD的減少在一定程度上促進了抗性基因豐度的降低。2.5反硝化基因與抗生素抗性基因的相關性為了進一步探究反硝化過程對土壤抗性基因的厭氧消減影響，本研究將反硝化基因豐度與磺胺類抗生素抗性基因豐度進行相關性擬合分析。由圖5可知：①反硝化基因豐度與抗性基因豐度呈現顯著的負相關，這一結果間接證明在厭氧條件下，土壤中添加了NO-3-N以后，微生物反硝化功能基因逐漸被激活，反硝化作用強度逐漸加強，更多的電子在厭氧氧化還原反應中被傳遞，從而反饋作用于抗生素的厭氧消減，進而有助于促進抗性基因的深度消減；②sulI/sulII與nirK/nirS的相關性〉sulI/sulII與nosZ的相關性，這可能是由于隨著反硝化過程的深入，完成整個反硝化過程的步驟環節逐漸增多，其反硝化基因的表達難度也在逐漸增加，因而反硝化基因的豐度可能會隨著反硝化進程的深入與磺胺類抗生素抗性基因豐度的相關性逐漸降低。2.6厭氧反硝化過程中土壤細菌群落結構變化及特征反硝化細菌的環境意義上述結果顯示強化的反硝化作用在一定程度上可以促進土壤中抗生素及抗性基因的厭氧消減，其中一些具有反硝化功能的厭氧細菌可能發揮了重要的作用，因而本研究對第1天和第60天的土壤樣品進行高通量測序分析發現（圖6）,主要是5個門的細菌群落發生了較為明顯的變化，分別是Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門），Actinobacteria（放線菌）、Chloroflexi（綠彎菌門）及Bacteroidetes（擬桿菌）。前人研究表明變形菌門和厚壁菌門的細菌往往屬于兼性厭氧或專性厭氧細菌，多數為化能異養型，此兩類細菌對于土壤氮素的轉化和利用具有較高的能力［30-32］。從圖6中可知，在T2處理下，60天后，變形菌門的細菌豐度顯著上升，并占據整個厭氧細菌群落的優勢生態位，說明添加了NO-3-N的處理，有助于激活土壤中變形菌門細菌的活性，進而有助于土壤反硝化的進程。此外，針對T2處理，本研究還在厭氧環境中分離篩選到16株具有反硝化功能同源于變形菌門(Proteobacteria)賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)的細菌，針對這些細菌進行反硝化功能基因和磺胺類抗性基因的PCR定性檢測發現(表2):該16株細菌通常在含有某一類或兩類反硝化功能基因的同時，也具備了sul類型的抗生素抗性基因，推測這些特殊的反硝化細菌，可能是在長期的自然進化中獲得了這些功能基因，表2中對這些細菌體內一型整合子intI基因的普遍檢出，也可以間接驗證此類假說。其中，整合子是一類與抗性基因水平轉移相關的可移動基因元件，整合子通常由一個編碼整合酶的intI基因、基因重組位點attI和attC、啟動子Pc構成，intI1最為常見，在細菌傳播中起重要作用［33］。當此類細菌同時具備了反硝化基因和抗生素抗性基因后，可以在抵御抗生素脅迫的同時，不斷地執行反硝化功能基因的表達，提升反硝化作用的速率和進程，從而反饋強化抗生素的厭氧消減，并進而促進抗生素抗性基因豐度的下降，最終有助于緩解土壤中抗生素抗性基因擴散傳播的風險。添加NO-3-N處理可以顯著強化土壤厭氧反硝化作用的速率和進程，同時土壤中磺胺嘧啶的消減速率和程度也得到顯著提升，進而有利于促進土壤中磺胺類抗性基因sulI和sulII的快速消減。土壤反硝化基因豐度與磺胺類抗性基因豐度呈顯著負相關，說明反硝化基因豐度表達越高，反硝化作用則越強，電子鏈的傳遞就越活躍，磺胺嘧啶的厭氧消減程度就越顯著，抗性基因豐度衰減就越明顯。同時分離篩選出的變形菌門細菌是土壤厭氧反應前后的主導優勢菌群，對于強化反硝化過程和促進磺胺嘧啶及sul抗性基因的消減發揮了潛在的積極作用。吳杭，白林泉,周秀芬，等.微生物藥物產生菌功能基因組學研究進展[J].中國抗生素雜志,2013,38(3):175-184代芳平,李師翁.鏈霉菌次級代謝物及其應用研究進展[J].生物技術通報，2014,(3):30-35BuQ,BinW,JunH,etal.PharmaceuticalsandpersonalcareproductsintheaquaticenvironmentinChina:Areview[J].JournalofHazardousMaterials,2013,262(22):189-211PhillipsPJ,SmithSG,KolpinDW,etal.Pharmaceuticalformulationfacilitiesassourcesofopioidsandotherpharmaceuticalstowastewatertreatmentplanteffluents[J].EnvironmentalScience&Technology,2010,44(13):4910-4916高盼盼，羅義，周啟星，等.水產養殖環境中抗生素抗性基因(ARGs)的研究及進展[J].生態毒理學報,2009(6):770-779FriedmanM.Antibiotic-resistantbacteria:Prevalenceinfoodandinactivationbyfood-compatiblecompoundsandplantextracts[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2015,63(15):3805-3822PrudenA,PeiR,HeatherStorteboomA,etal.Antibioticresistancegenesasemergingcontaminants:StudiesinNorthernColorado[J].EnvironmentalScience&Technology,2006,40(23):7445-7450邰義萍，莫測輝,李彥文，等.長期施用糞肥土壤中喹諾酮類抗生素的含量與分布特征[J].中國環境科學,2010(6):816-821ArchundiaD,DuwigC,LehembreF,etal.AntibioticpollutionintheKatarisubcatchmentoftheTiticacaLake:Majortransformationproductsandoccurrenceofresistancegenes[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2017,576:671-682秦麗婷,童蕾，劉慧，等.環境中磺胺類抗生素的生物降解及其抗性基因污染現狀[J].環境化學,2016(5):875-883金彩霞,高若松,吳春艷.磺胺類藥物在環境中的生態行為研究綜述[J].浙江農業科學,2011(1):127-131MohapatraDP,BrarSK,TyagiRD,etal.Analysisandadvancedoxidationtreatmentofapersistentpharmaceuticalcompoundinwastewaterandwastewatersludge-carbamazepine[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2014,470-471(2):58-75MasseDI,CataSaadyNM,GilbertY.Potentialofbiologicalprocessestoeliminateantibioticsinlivestockmanure:Anoverview[J].Animals,2014,4(2):146-163DaiX,FanL,JingY,etal.Biodegradationofpolyacrylamidebyanaerobicdigestionundermesophilicconditionanditsperformanceinactualdewateredsludgesystem[J].BioresourceTechnology,2013,153(2):55-61孫明明,滕應,駱永明.厭氧微生物降解多環芳烴研究進展[J].微生物學報，2012,52(8):931-939羅凱,李文紅,章海波，等.南京典型設施菜地有機肥和土壤中四環素類抗生素的污染特征調查[J].土壤,2014,46(2):330-338MuQ,LiJ,SunY,etal.Occurrenceofsulfonamide-,tetracycline-,plasmid-mediatedquinolone-andmacrolide-resistancegenesinlivestockfeedlotsinNorthernChina[J].EnvironmentalScienceandPollutionResearch,2015,22(9):6932-6940AwadYM,KimSC,El-AzeemSAMA,etal.Veterinaryantibioticscontaminationinwater,sediment,andsoilnearaswinemanurecompostingfacility[J].EnvironmentalEarthSciences,2014,71(3):1433-1440TakayaN,CatalansakairiMAB,SakaguchiY,etal.Aerobicdenitrifyingbacteriathatproducelowlevelsofnitrousoxide[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2003,69(6):3152-3157續勇波,蔡祖聰.亞熱帶土壤亞鐵與厭氧反硝化[J].土壤,2015,47(1):63-67GuoGX,DengH,QiaoM,etal.Effectoflong-termwastewaterirrigationonpotentialdenitrificationanddenitrifyingcommunitiesinsoilsatthewatershedscale[J].EnvironmentalScience&Technology,2013,47(7):3105-3113張晶,林先貴,尹睿.參與土壤氮素循環的微生物功能基因多樣性研究進展[J].中國生態農業學報,2009,17(5):1029-1034郭麗蕓，時飛，楊柳燕.反硝化菌功能基因及其分子生態學研究進展[J].微生物學通報,2011,38(4):583-590ZhangDQ,TanSK,GersbergRM,etal.Nutrientremovalintropicalsubsurfaceflowconstructedwetlandsunderbatchandcontinuousflowconditions[J].JournalofEnvironmentalManagement,2012,96(1):1-