1病原微生物菌（毒）種分離和鑒定方法施萬菌本文件規定了施萬菌的分離和鑒定方法。本文件適用于全國各級病原微生物菌（毒）種保藏機構，以及涉及人間傳染的施萬菌研究、教學、檢測、診斷等相關活動的機構。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/CPMA011病原微生物菌（毒）種保藏數據描述通則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1病原微生物pathogenicmicroorganisms可以侵犯人、動物，引起其感染甚至傳染病的微生物。[來源：中華人民共和國生物安全法（2020年10月17日）第八十五條（六有修改]3.2菌（毒）種microorganismstrains可培養的，人間傳染的病毒、細菌、真菌、立克次體等具有保存價值的，經鑒定、分類并給予固定編號的微生物。[來源：T/CPMA011病原微生物菌（毒）種保藏數據描述通則，有修改]3.3施萬菌屬Shewanellaspp.革蘭染色陰性菌、具有單極鞭毛、兼性厭氧，主要生化特征為氧化酶、過氧化氫酶陽性，可產H2S，廣泛分布于海洋環境和水生生物中，可造成海產品、禽畜肉制品腐敗，是水生動物和人類的機會致病菌，在人體可導致皮膚和軟組織感染、菌血癥、肝膽疾病、中耳炎和其他感染。24縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：堿基對（Basepair）MLSA：多位點序列分析（MultilocusSequenceAnalysis）PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）5設備和材料5.2恒溫培養箱：36℃±1℃。5.3離心機：離心力≥20000g。5.4天平：感量0.001g。5.5顯微鏡：10倍~100倍，有相差功能。5.6培養皿：直徑90mm或60mm。5.7pH計或pH比色管或精密pH試紙。5.8震蕩器。5.9全自動微生物生化鑒定系統。5.10飛行時間質譜儀。5.11微量移液器：量程10μL、200μL和1000μL。5.12無菌刻度移液管：10mL。5.13無菌離心管：1.5mL、15mL和50mL。5.14無菌吸頭：10μL、200μL和1000μL。5.15無菌PCR管：0.2mL。5.16基因擴增儀。5.17水平電泳儀：包括電源、電泳槽、膠槽和梳子。5.18凝膠成像系統。6培養基和試劑6.1施萬菌增菌液：配制方法按照附錄B.1。6.2硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂：配制方法按照附錄B.2。6.3營養瓊脂：配制方法按照附錄B.3。6.4三糖鐵瓊脂（TSI配制方法按照附錄B.4。6.5革蘭染色液：配制方法按照附錄B.5.1~B.5.3。6.6氧化酶試劑：配制方法按照附錄B.6。6.7屬特異性PCR引物：合成方法按照表1。6.8滅菌去離子水。6.90.85%滅菌生理鹽水。6.1010×PCR反應緩沖液。6.1125mmol/LMgCl2。6.12dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP每種濃度為2.5mmol/L。6.135U/LTaq酶。6.14瓊脂糖。6.155×TBE電泳緩沖液：配制方法按照附錄B.7。6.16DNA分子量標準（DNAMarker范圍100bp~2000bp。7分離和鑒定程序分離和鑒定程序見圖1。樣品（臨床、食品、環境）樣品處理增菌：施萬菌增菌液分離培養：TCBS平板中等大小、圓形、光滑凸起、綠色不透明，帶或不帶黑色中心營養瓊脂平板初步鑒定：革蘭染色（-），氧化酶（+），三糖鐵瓊脂反應為斜面產堿、底層產酸、產硫化氫微生物鑒定系統鑒定實驗PCR確證實驗rpoA特異基因（+） 報告檢出施萬菌MLSA分析（種水平鑒定，可選）圖1施萬菌分離鑒定流程圖48操作步驟8.1樣品類型和處理8.1.1樣品類型8.1.1.1臨床樣品：包括糞便、尿液、嘔吐物、痰液、腦脊液、肛拭子、皮膚化膿性病灶等。8.1.1.2食品樣品：包括乳制品、肉制品、水產制品、即食蛋制品、糧食制品、即食豆制品、即食果蔬制品等預包裝食品。8.1.1.3環境樣品：包括水體、市場各水產或肉類檔口、各超市生鮮類柜臺和餐廳廚房的環境，包括案板、器具物表、餐具、儲存冰箱或冷庫內表面、污水、工作人員手部等多點涂抹樣品。8.1.2樣品處理8.1.2.1臨床樣品：以無菌操作稱取待檢樣品0.5g（mL）[不足0.5g（mL）取其全部]，加入裝有10mL施萬菌增菌液的試管中，震蕩混勻。8.1.2.2食品樣品：以無菌操作取食品樣品25g（mL）[不足25g（mL）取其全部]，加入裝有225mL施萬菌增菌液的均質袋，或放入盛有225mL施萬菌增菌液的無菌錐形瓶中，用拍擊式均質器均質1min~2min，震蕩混勻。8.1.2.3環境樣品：環境物體表面，使用滅菌干燥棉拭子于10mL施萬菌增菌液內浸潤后，在物體表面的適當部位來回均勻涂抹進行樣品采集，再用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸部分，將棉拭子放入增菌液試管中，震蕩混勻。環境水體樣品量取樣品50mL，加入裝有450mL施萬菌增菌液的無菌錐形瓶中，震蕩混勻。8.2增菌將樣品勻液置于恒溫生化培養箱，36℃±1℃培養18h~24h。8.3分離培養用無菌接種環取增菌液，劃線接種TCBS瓊脂平板，于恒溫培養箱36℃±1℃培養18h~24h。施萬菌在TCBS瓊脂培養基上疑似菌落為中等大小、圓形、光滑凸起、綠色不透明，帶或不帶黑色中心。挑取3個或以上可疑菌落，劃線接種營養瓊脂平板，于恒溫培養箱36℃±1℃培養18h~24h。8.4初步鑒定8.4.1氧化酶實驗取一條濾紙，沾取營養瓊脂上的菌落少許。然后加一滴二鹽酸四甲基對苯二胺試劑，僅使濾紙濕潤，不可過濕，在10s內，菌落呈玫瑰紅色然后到深紫色者為氧化酶陽性。60s以上出現紅色者，按陰性處理。施萬菌為氧化酶陽性。8.4.2涂片和革蘭染色鏡檢8.4.2.1涂片：以滅菌接種環取一滴鹽水放于清潔玻片上，然后挑取少許細菌與鹽水混勻，均勻涂布。8.4.2.2干燥：將標本涂好后，使自然干燥，或在火焰上略烘，但防止過熱。8.4.2.3固定：將已干燥標本在火焰上來回通過3~4次，可使細菌固定在玻片上。8.4.2.4染色：在涂片上加結晶紫染液1min后，用自來水沖洗，將水瀝凈。加碘液作用1min后，水洗瀝凈。用95%的酒精，約10s~30s，水洗。加稀釋復紅染30s，水洗，用濾紙吸干。58.4.2.5觀察結果：涂片干燥后，加香柏油鏡檢。革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色。施萬菌為革蘭陰性，呈桿狀，無芽胞，有鞭毛。8.4.3三糖鐵瓊脂（TSI）實驗：以接種針挑取營養瓊脂上的單個菌落，先穿刺接種到TSI深層，距管底3mm~5mm為止，再從原路退回，在斜面自下而上劃線，于恒溫培養箱36°C±1°C培養18h~24h觀察結果。產生黑色沉淀即表明產生了H2S；發酵乳糖或蔗糖的細菌使整個培養基呈現黃色；只能利用葡萄糖的細菌則斜面變紅，底部仍保持黃色。施萬菌在TSI中的反應為斜面產堿、底層產酸、產硫化氫。8.5微生物系統鑒定實驗挑取疑似純菌落，按照微生物鑒定系統的要求進行操作，鑒定結果為施萬菌（Shewanella）或該屬的某個種，如海藻施萬菌（Shewanellaalgae）、腐敗施萬菌（Shewanellaputrefaciens）時，為施萬菌微生物鑒定系統實驗陽性。微生物鑒定系統包括全自動生化鑒定儀和飛行時間質譜儀。8.6PCR確證實驗8.6.1核酸模板制備使用1μL接種環刮取營養瓊脂上培養18h~24h的菌落,懸浮在200μL0.85%滅菌生理鹽水中，充分打散制成菌懸液，于100℃水浴或者金屬浴維持10min；冰浴冷卻后，13000r/min離心3min，收集上清液作為PCR檢測的模板；所有處理后的DNA模板直接用于PCR反應或暫存于4℃并當天進行PCR反應；否則，應在-20℃以下保存備用(1周內)。也可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。每次PCR反應使用國家病原微生物菌（毒）種保藏中心（CHPC）的標準株CHPC1.2562作為陽性對照。同時，使用氣單胞菌CHPC1.261或等效標準菌株作為陰性對照，以滅菌去離子水作為空白對照，控制PCR體系污染。8.6.2PCR反應體系使用去離子水將合成的施萬菌屬特異性引物（見表1）干粉稀釋成100μmol/L儲存液。繼續配制成10×引物工作液2μmol/L，PCR反應體系中引物的終濃度為0.2μmol/L。將10×引物工作液、10×PCR反應緩沖液、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTPs、滅菌去離子水從-20℃冰箱中取出，融化并平衡至室溫，使用前混勻；5U/μLTaq酶在加樣前從-20℃冰箱中取出。每個樣品按照表2的加液量配制25μL反應體系。表1施萬菌PCR實驗用引物rpoA-27-F6表2施萬菌PCR體系配制表25mmol/LMgCl25U/μLTaq酶8.6.3PCR擴增條件94°C預變性10min，然后94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸60s，進行35個循環，最后72°C延伸10min。8.6.4擴增產物分析PCR擴增結束后，取5μL產物上樣于1%瓊脂糖凝膠中，在120V電壓下電泳45min，驗證是否為單一條帶并位于相應的片段大小位置上。8.6.5結果判定rpoA基因陽性者判定為施萬菌。8.6.6種水平的鑒定（選做）見附錄C（資料性附錄）施萬菌種水平的鑒定（MLSA法）。7（資料性）施萬菌病原學和感染特點A.1病原學施萬菌屬（Shewanella）在分類學上屬于交替單胞菌目施萬菌科。自1985年被正式命名至今已陸續報道了超過70個種。常見的種有海藻施萬菌（S.algae）、腐敗施萬菌（S.putrifaciens）、廈門施萬菌（S.xiamenensis）等。該菌屬細菌為革蘭陰性菌，其中大部分細菌屬于非發酵菌，不同種施萬菌在同一培養基上的菌落形態基本相同。作為海洋微生物，最初用海洋瓊脂培養基2216E分離，形成圓形、凸起、光滑、中等大小的菌落。主要生化特征為氧化酶陽性，過氧化氫酶陽性，吲哚陰性，不發酵乳糖、分離到的菌株大多為產H2S、尿素陰性、精氨酸水解酶陰性、賴氨酸脫羧酶陰性，單極性鞭毛運動，不能利用檸檬酸鹽。由于種間表型特征幾乎相同，區分不同菌種的生化指標有限，很難應用于施萬菌種的檢測鑒定。為快速從屬水平甚至種水平鑒定施萬菌，可以對施萬菌進行管家基因的種屬特異性檢測，例如本團標中使用的管家基因rpoA的屬特異性PCR檢測方法，和基于六個管家基因的施萬菌種水平的MLSA鑒定方法。A.2感染特點施萬菌感染在地理環境分布上，大多數病例所處位置為氣候相對溫暖的地區。由于水環境中相對豐富的施萬菌，人類感染途徑包括娛樂（潛水、海灘游玩）、職業性暴露(捕蟹、捕魚)、食用海鮮、含有施萬菌的海洋生物(海膽、魚)所造成的穿刺傷口，或傷口直接暴露于水生環境中，由此增加了海洋獲得性感染的風險。施萬菌可在不愈合的傷口或慢性潰瘍上定植、感染，或經血向更深的組織中進行潛行擴展而穿透創傷，可在人體脾臟、會陰和手指等多個部位導致膿腫潰瘍。施萬菌也可造成海產品、禽畜肉制品腐敗，人類直接接觸未煮熟的海產品和禽畜肉制品后，可引起中耳炎、軟組織感染、腸胃炎等病癥。8B.1施萬菌增菌液蛋白胨氯化鈉酵母粉去離子水（規范性）培養基和試劑30.0g5.0g1000mL將上述成分混合溶解后，校正pH至7.2±0.2，于121℃高壓蒸汽滅菌15min。B.2硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂酵母粉5.0g蛋白胨硫代硫酸鈉枸櫞酸鈉牛膽粉5.0g牛膽酸鈉3.0g蔗糖20.0g氯化鈉檸檬酸鐵麝香草酚蘭0.04g瓊脂去離子水1000mL將各成分溶于去離子水中，校正pH至8.6±0.2，加熱煮沸至完全溶解，冷至50℃左右傾注平板備用。B.3營養瓊脂蛋白胨氯化鈉牛肉膏瓊脂去離子水3.0g1000mL將上述成分混合溶解后，校正pH至7.2±0.2，121℃高壓蒸汽滅菌15min。B.4三糖鐵瓊脂（TSI）蛋白胨20.0g牛肉?膏5.0g氯化鈉5.0g乳糖蔗糖葡萄糖酚紅硫酸亞鐵銨硫代硫酸鈉瓊脂去離子水0.025g0.2g0.2g1000mL除酚紅和瓊脂外，將其它成分加于400mL去離子水中，攪拌均勻，靜置約10min，加熱使完全溶化，冷卻至25℃左右校正pH至7.4±0.2。另將瓊脂加于600mL去離子水中，靜置約10min，加熱使完全溶化。將兩液混合均勻，加入5%酚紅水溶液5mL，混勻，分裝小號試管，每管約3mL。于121℃高壓蒸汽滅菌10min或115℃高壓蒸汽滅菌15min，制成高層斜面，冷卻后呈桔紅色，放2℃~8℃條件下備用。B.5革蘭染液B.5.1結晶紫染色液結晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液20mL80mL將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨水溶液混合。B.5.2革蘭碘液碘碘化鉀去離子水2.0g300mL將碘與碘化鉀先行混合，加入去離子水少許，充分振搖，待完全溶解后，加去離子水定容至300mL。B.5.3沙黃復染液沙黃95%乙醇去離子水0.25g10mL90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用去離子水稀釋。B.6氧化酶試劑二鹽酸四甲基對苯二胺去離子水100mL稱取1.0g二鹽酸四甲基對苯二胺，加入去離子水少許，充分振搖，待完全溶解后，加去離子水定容至100mL。冰箱內避光保存，在7天之內使用。B.75×TBE電泳緩沖液Tris堿硼酸Na2EDTA·2H2O去離子水54.027.53.721000mL將上述成分混合溶解，室溫保存。瓊脂糖凝膠電泳時使用濃度為0.5×。（規范性）施萬菌種水平的鑒定（MLSA法）C.1核酸模板制備按照8.6.1進行操作。C.2PCR反應體系管家基因的上下游引物見表C.1。PCR反應體系按照8.6.2進行操作。表C.1施萬菌PCR管家基因引物gyrAgyrBUP-2rinfBrecNrecN-415FrpoA-83FtopA-929RC.3PCR擴增條件94°C預變性10min，然后94°C變性30s，54～60°C退火30s，72°C延伸60s，進行35個循環，最后72°C延伸10min。對于上述6對管家基因，PCR擴增的退火溫度見表C1。C.4擴增產物分析PCR擴增結束后，取5μL產物于1%瓊脂糖凝膠中，在120V電壓下電泳45min，驗證是否為單一條帶并位于相應的片段大小位置上。剩余產物使用相應管家基因引物進行雙向測序。C.5構建MLSA進化樹將測序獲得的實驗菌株gyrA、gyrB、infB、recN、rpoA和topA基因分別對應大腸桿菌56-1455、247-744、337-1446、1519-2181、565-1200、139-756和106-768的基因位點截齊，然后將六個管家基因序列按gyrA-gyrB-infB-recN-rpoA-topA順序依次串聯。并以施萬菌種模式菌株相應管家基因序列作為參考（見表C.2），參考序列的截齊與串聯同實驗菌株序列。匯總實驗菌株與模式菌株六個基因的串聯序列，利用MEGA軟件，對六基因串聯序列進行鄰接法（Neighbour-Joining）系統進化樹構建，替代模型選擇Kimura兩參數模型（Kimura’s2-parameter）；空位處理原則使用成對刪除（pairwisedeletion）選項；自展分析（bootstrapanalysis）設定為1000次重復抽樣，根據系統進化樹聚類結果進行實驗菌株種水平的鑒定。表C.2施萬菌管家基因參考序列在GenBank中的序列號gyrAgyrBinfBrecNC.6結果判定實驗菌株與某種施萬菌MLSA進化樹分支聚類為一簇，則該實驗菌株判定為該種施萬菌。參考文獻[1]JandaJM,AbbottSL.Thegenu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