序號：編碼：第十屆“挑戰杯”廣東大學生課外學術科技作品競賽作品申報書作品名稱：豬生長抑素（SS）RNAi效應的假型慢病毒制備學校全稱：華南農業大學申報者姓名（集體名稱）：張雨微類別：□√自然科學類學術論文 □哲學社會科學類社會調查報告和學術論文□科技發明制作A類□科技發明制作B類說明1．申報者應在認真閱讀此說明各項內容后按要求詳細填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據作品類別（自然科學類學術論文、哲學社會科學類社會調查報告和學術論文、科技發明制作）分別填寫B1、B2或B3表。所有申報者可根據情況填寫C表。3．表內項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復制。4．序號、編碼由第十屆“挑戰杯”廣東大學生課外學術科技作品競賽組委會填寫。5．學術論文、社會調查報告及所附的有關材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上（文章版面尺寸14.5×22cm），附于申報書后，論文不超8000字，調查報告不超15000字。6．作品申報書須按要求由各校競賽組織協調機構統一寄送。7．其他參賽事宜請向本校競賽組織協調機構咨詢。A1．申報者情況（個人項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫，申報者情況欄內必須填寫個人作品的第一作者（承擔申報作品60%以上的工作者）；2．本表中的學籍管理部門簽章視為對申報者情況的確認。姓名張雨微性別女出生年月1988年5月申報者情況學校全稱華南農業大學專業動物生物技術現學歷本科年級三學制四年入學時間2006年9月作品全稱豬生長抑素(SS)RNAi效應的假型慢病毒制備畢業論文題目通訊地址華南農業大學華山學生宿舍23棟505郵政編碼510640單位電話常住地通訊地址華南農業大學華山學生宿舍23棟505郵政編碼510640住宅電話合作者情況姓名性別年齡學歷所在單位葉康男21本科華南農業大學資格認定學校學籍管理部門意見是否為2009□√是□否若是，其學號為：100000000001（部門蓋章）2009年4月13日院系負責人或導師意見本作品是否為課外學術科技或社會實踐活動成果□√是□否負責人簽名：2009年4月13日B1．申報作品情況（自然科學類學術論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內容的確認；3．作品分類請按作品的學術方向或所涉及的主要學科領域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱豬生長抑素（SS）RNAi效應的假型慢病毒制備作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．數理（包括數學、物理、地球與空間科學等）D．生命科學（包括生物、農學、藥學、醫學、健康、衛生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學、化工、生態、環保等）作品撰寫的目的和基本思路SS于1972年首次發現能抑制GH的分泌，目前在生產上采取降低SS水平，解除SS對GH、IGF－I等的抑制，達到促進動物生長的目的。隨著胚胎技術和轉基因技術的發展，在動物整體水平上敲除或沉默目的基因或導入外源基因改良動物的生產性能已得到了廣泛的研究與應用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達水平可長久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉基因動物。本實驗在已有研究的基礎上，擬選擇在動物生長調控中起重要作用的負調節因子-生長抑素（SS）作為靶基因，制備最優RNAi效應的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長的優良轉基因動物，并為研究動物生長調控提供有益的動物模型。作品的科學性、先進性及獨特之處（1）在方法上創新性為動物整體水平上緘默SS基因表達提供優良RNAi效應的shRNA序列；（2）在思路上前沿性提出利用慢病毒載體與RNAi技術相結合廉價，為快速生產SS基因部分緘默的轉基因動物模型奠定一定的實驗基礎。作品的實際應用價值和現實意義本實驗選擇在動物生長調控中起重要作用的負調節因子-生長抑素（SS）作為靶基因，制備最優RNAi效應的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長的優良轉基因動物，為畜牧業動物育種改良可提供良好的經濟利益和社會效益，也為這項技術早日進入實際應用打下基礎，并可為研究動物生長調控提供有益的動物模型。學術論文文生長抑素SS是動物生長激素GH釋放的負性因子，其在血液中濃度下降（如免疫中和）能間接促進動物生長、提高動物的生產性能。下調SS基因的表達成了改良動物生長性能的方法。我們用基因轉染技術在動物體內表達SS-HBsAg融合蛋白產生中和抗體得到促生長效果。RNAi緘默靶基因的表達在多種生物體內獲得成功應用。shRNA是模仿體內miRNA的結構而構建的能在細胞內表達的短發夾RNA，引起特異的RNAi效應。慢病毒載體能感染分裂細胞也能感染靜止細胞，有很強的感染和整合能力，是目前應用前景廣泛的一種基因轉移載體。摘本研究在以往工作基礎上，結合RNAi和慢病毒載體技術，設計和篩選產生SS靶基因RNAi效應的shRNA表達序列，以便通過慢病毒載體的介導下整合到動物胚胎細胞染色體上，生產出攜帶SS-shRNA的轉基因動物。通過RNAi效應在動物整體水平上緘默SS的表達，從遺傳改造的角度達到提高動物生長性能的目的。為提高畜牧業動物生產性能打下理論和實踐的基礎，同時為動物生長調節的研究建立良好動物模型。作品在何時、何地、何種機構舉行的會議上或報刊上發表及所獲獎勵2008年中國畜牧獸醫學會動物生理生化學分會（西安.楊凌）《畜牧與獸醫》增刊：《慢病毒載體介導的RNA干擾生長抑素表達下調及轉基因動物模型的建立》；2009年“挑戰杯”華南農業大學大學生課外學術科技作品競賽二等獎。鑒定結果無請提供對于理解、審查、評價所申報作品具有參考價值的現有技術及技術文獻的檢索目錄SS基因RNAi干涉效果的篩選慢病毒載體的制備DieckhoffB,PetersenB,KuesWA.,KurthR,NiemannH,DennerJ.Knockdownofporcineendogenousretrovirus(PERV)expressionbyPERV-specificshRNAintransgenicpigs.Xenotransplantation.2008;15:36-45.白莉，楊忠亮，李榮田．2008．用于RNA干涉的siRNA的設計與合成．黑龍江科技信息．06：2申報材料清單（申報論文一篇，相關資料名稱及數量）《豬生長抑素（SS）RNAi效應的假型慢病毒制備》動物的生產性能是畜牧業發展過程中的重要經濟性狀，生長抑素(SSI)是抑制動物生長的主要因素。SST主動免疫和添加SST抑制劑雖然取得了一定的效果但是仍不理想，而傳統的育種方法在改善動物的生長性能方面進程非常緩慢，因而探索探索新的方法和技術十分必要。RNAi是下調靶基因的有效方法，慢病毒載體也是目前應用前景最廣泛的基因轉移載體，本試驗根據靶基因SST設計和篩選出了最優RNAi效應的靶基因-shRNA序列，并已成功構建到慢病毒載體上，通過慢病毒載體和精原干細胞介導聯合制備出穩定表達靶基因-shRNA的可遺傳的轉基因動物，利用RNAi效應在動物整體水平上下調SST的表達，從而到達提高動物生產性能的目的?？蒲泄芾聿块T簽章年月日C.當前國內外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。（1）生長抑素對生長激素分泌的負調控：生長激素（growthhormone,GH）是調節動物和人生長的主要激素，由垂體分泌，主要受下丘腦分泌的正性調控因子即生長激素釋放因子（growthhormonereleasingfactor,GRF）或稱生長激素釋放激素（growthhormonereleasinghormone,GHRH）和負性調控因子即生長激素釋放抑制激素（somatostatin,SS）或簡稱生長抑素的雙向調節。研究表明SS能抑制腦垂體細胞的cAMP生成，提高cGMP濃度，抑制GH的合成與釋放，降低血液GH濃度。同時SS還能調節GRF的釋放，影響GRF基因的表達，通過拮抗GRF的作用以協同控制GH的水平。（2）生長抑素在動物促生長領域的應用：GH的水平影響骨、軟骨的生長以及肌蛋白的合成與沉積等，從而影響動物和人的生長狀況。在生產應用上GH具有促生長，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高飼料轉化率等方面的作用，有著廣泛的經濟價值和社會效益。生長抑素（SS）通過抑制垂體分泌GH，從而降低GH水平。目前在生產上采取降低SS水平，解除SS對GH、IGF－I等的抑制，達到促進動物生長的目的，如主動免疫技術。隨著胚胎技術和轉基因技術的發展，在動物整體水平上敲除或沉默目的基因或導入外源基因改良動物的生產性能已得到了廣泛的研究與應用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達水平可長久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉基因動物。（3）RNAi技術制備轉基因動物：RNAi（RNAinterference）稱為RNA干涉，通過雙鏈RNA（dsRNA）誘導與之同源的mRNA降解，導致目標基因轉錄后緘默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）的現象或機制。在動物機體中，有兩種小分子RNA能介導這種現象的發生，microRNA(miRNA)和siRNA。前者形成分子內雙鏈RNA，后者形成分子間雙鏈RNA，兩者雙鏈RNA在細胞質內經Dicer酶切割成長度約為21~25個nt片段，即小分子雙鏈RNA。在解旋酶(helicase)的作用下解開雙鏈RNA，其中僅保留一條RNA鏈與RNA誘導的沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)結合，根據堿基互補配對原則識別靶mRNA，引起靶mRNA被剪切降解或翻譯的抑制。2002年，Hasuwa等人成功地建立了第一例應用RNAi的轉基因小鼠。幾乎同時多數研究者們利用RNA聚合酶III的啟動子構建shRNA的載體應用于轉染哺乳動物的細胞系，結果對靶基因均產生了穩定的轉錄后緘默效果，表達下降90%以上。2006年Dann等人通過慢病毒介導RNAi敲除了大鼠上的Dazal基因，構建了兩條shRNA序列（pLLU2G-Dazl1和pLLU2G-Dazl2），結果這兩條轉基因序列對靶基因Dazal的表達均產生了幾乎完全的抑制，并在后代中獲得了穩定的可遺傳的Dazl-shRNA轉基因大鼠。shRNA轉基因小鼠或大鼠的出現使得RNAi技術在哺乳動物整體水平上進行靶基因的敲低或緘默成為可能。研究表明與建立在胚胎干細胞和同源重組技術上的基因敲除相比，用RNAi技術建立轉基因動物無論是時間上還是在效率上都有著很大的優勢。（4）慢病毒載體的特點與構建：慢病毒（lentivirus）是一種逆轉錄病毒，引起慢性感染得名。與其他逆轉錄病毒相比不僅感染分裂細胞、也感染非分裂細胞，即靜止細胞如神經細胞、巨嗜細胞、造血干細胞和肌肉細胞等，大大提高了感染效率，感染之后能高效整合和表達目的基因。用慢病毒載體感染動物卵母細胞和胚胎細胞能有效構建轉基因動物。Hofmann等用含GFP目的基因的慢病毒載體轉染豬胚胎，產下46只小豬中，有32只攜帶GFP基因，其中30只能表達GFP。同時用該載體轉染牛的卵母細胞時也獲得了GFP高表達率。慢病毒載體（lentiviralvector,LV）的構建原理是將HIV-1基因組中的順式作用元件（如包裝信號和長末端重復序列）和編碼反式作用蛋白的序列分離。載體系統分成包裝部分和載體部分，其中包裝部分由去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列構成，僅提供病毒包裝所需蛋白；載體部分與包裝部分互補，含包裝、逆轉錄和整合所需順式作用序列。（5）慢病毒載體制備轉基因動物的應用：慢病毒載體（LV）于1996年發展以來只是用于細胞轉染和基因治療的研究，但直到2002年Lois等將其用于轉基因大鼠和小鼠的制備，之后LV在制備轉基因動物上獲得極大的發展與應用。與顯微注射法相比，免去了操作困難、效率低下和成本過高的缺點。LV法相對操作簡單、整合能力強，通過感染早期胚胎或受精卵細胞即可獲得轉基因胚胎。由于LV的高效率感染和在宿主細胞DNA上的高度整合特性，可以大大提高外源基因的轉移效率。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業技術職稱，并是與申報作品相同或相關領域的專家學者或專業技術人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認。推薦者情況姓名張永亮性別男年齡46職稱教授/博導工作單位華南農業大學動物科學學院通訊地址廣州市天河區五山郵政編碼510642單位電話住宅電話推薦者所在單位簽章張永亮老師是華南農業大學動物科學學院院長，動物營養系教授、博士生導師。全國動物生理生化分會副理事長、農業生化與分子生物學分會理事、吉林省生化與分子生物學理事、全軍專業生化委員會委員，《中國獸醫學報》編委。（簽章）2009年4月13日請對申報者申報情況的真實性作出闡述申報內容真實可信，已有一定的實驗基礎。請對作品的意義、技術水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價該作品具備較好的前期基礎，具有一定得科學研究價值。研究手段較先進，技術路線明確，實驗條件具備。所獲慢病毒是一種廣泛應用的基因轉移載體，所獲轉基因動物具有較好的示范和推廣前景。值得進一步推廣和應用。其它說明推薦者情況姓名張守全性別男年齡45職稱教授/博導工作單位華南農業大學動物科學學院通訊地址廣州市五山路483號郵政編碼510642單位電話住宅電話推薦者所在單位簽章張守全老師是華南農業大學動物科學學院副院長，動物遺傳育種與繁殖系教授、博士生導師，廣東省高等學校“千百十工程”校級培養對象。目前兼職廣東省人體組織工程學會常務理事；廣東省養豬行業協會顧問等。（簽章）2009年4月13日請對申報者申報情況的真實性作出闡述該研究結果由張雨微、葉康兩位同學在導師的指導下完成的。請對作品的意義、技術水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價該作品以生長抑素（SS）作為靶基因，制備優化了RNAi效應的假型慢病毒，以期獲得促生長的轉基因動物，為畜牧業動物育種改良可提供良好的經濟利益和社會效益，并可為研究動物生長調控提供有益的動物模型。該研究成果通過中試后，可在畜牧生產應用，應用前景較廣。其它說明學校組織協調機構確認并蓋章（團委代章）2009年4月13日校主管領導或校主管部門確認蓋章2009年4月13日E．大賽組織委員會秘書處資格和形式審查意見組委會秘書處資格審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處形式審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處審查結果□合格□不合格負責人（簽名）年月日豬生長抑素（SS）RNAi效應的假型慢病毒制備作者：張雨微葉康指導老師：張永亮教授習欠云講師作者單位：華南農業大學動物科學學院，廣州，510640【摘要】生長抑素(SST)是抑制動物生長的主要因子。SST主動免疫和添加SST抑制劑對提高動物生長取得了一定的效果但仍不理想，而傳統的育種方法在改善動物的生長性能方面進程非常緩慢，因而探索探索新的方法和技術十分必要。RNAi是下調靶基因的有效方法，慢病毒載體也是目前應用前景最廣泛的基因轉移載體。本研究根據靶基因SST設計和篩選出了最優RNAi效應的靶基因-shRNA序列，通過RIA檢測轉染細胞裂解液中SS濃度，結果表明SS-shRNA產生的siRNA對SST基因表達抑制率為86.3-87.9%。并已成功將SS-shRNA序列構建到慢病毒載體上，利用慢病毒四質粒系統成功包裝出假病毒顆粒，經測定病毒原液的滴度達到5×104ifu/ml，超速離心后病毒滴度為5×109ifu/ml，該病毒滴度完全滿足慢病毒介導轉基因動物的制備的需要。本研究為下一步慢病毒載體與動物生殖細胞聯合介導制備靶基因-shRNA表達的轉基因動物，通過RNAi效應在動物整體水平上下調SST的表達，提高動物生產性能提供了前期實驗基礎?！娟P鍵詞】生長抑素RNAi效應假型慢病毒【正文】1引言1.1生長抑素在動物促生長領域的應用動物生長的過程受很多激素調節，其中生長激素（GH，GrowthHormone）是調節動物生長的核心之一。GH的水平影響骨、軟骨的生長以及肌蛋白的合成與沉積等，從而影響動物和人的生長狀況。在生產應用上GH具有促生長，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高飼料轉化率等方面的作用，有著廣泛的經濟價值和社會效益。生長抑素（SS）通過抑制垂體分泌GH，從而降低GH水平。目前在生產上采取降低SS水平，解除SS對GH、IGF－I等的抑制，達到促進動物生長的目的，如主動免疫技術。隨著胚胎技術和轉基因技術的發展，在動物整體水平上敲除或沉默目的基因或導入外源基因改良動物的生產性能已得到了廣泛的研究與應用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達水平可長久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉基因動物。1.2慢病毒載體與RNAi技術聯合介導轉基因動物目前制約轉基因動物產業化的瓶頸問題主要表現在轉基因成本高、效率低、外源基因表達量不高以及遺傳性狀不穩定等方面。在已建立的轉基因方法中，比較成熟的有顯微注射法和體細胞克隆法，目前多種轉基因動物是通過這兩種方法獲得的。DNA顯微注射法是最早出現的一種轉基因方法，該方法需要嚴格的顯微操作技術，制作成本高（6-30萬美元）、效率低（<1%）等特點，比較難以大眾化推廣應用。體細胞核移植法是目前認為效率較高、應用廣泛的一種轉基因方法。該法在連續的胚胎克隆會積累后成遺傳的錯誤，降低了克隆的效率。因此通過克隆方法增加個體后代比較困難。雖然該法轉基因率100%，但由于克隆胚胎的制備成功率為0.05-1.2%，因而整個轉基因效率跟顯微注射法差不多。此外，胚胎干細胞法目前在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚，還不成熟。其他幾種方法相對操作簡單、成本低，但還沒有成熟。如逆轉錄病毒載體介導法、精子介導基因轉移法以及睪丸介導基因轉移法等均存在外源基因整合效率差的問題。尋找和探索高效、經濟、便捷的轉基因的新技術和新方法有著重要的意義和緊迫性。慢病毒（lentivirus，LV）載體法是近年來發展起來的一種有效的基因轉移載體。由于其高整合和高表達效應、低成本和操作簡單等優點有望成為一種應用廣泛的新型基因轉移載體。目前利用慢病毒載體在許多動物上獲得了成功，如小鼠、大鼠、牛、豬、羊等。與其它逆轉錄病毒載體法相比，慢病毒不僅可以感染靜止細胞，還能感染分裂細胞，極大地提高了感染力；同時研究表明將慢病毒載體LTRs內增強子和啟動子用通用或組織特異性啟動子取代，轉基因豬生產效率可達到31%，表達效率達90%以上，表明除了高的感染力、很高的整合效率和表達效率，同時成本大約是顯微注射法的十分之一。很有希望發展成為簡捷、高效、低成本的轉基因技術。但是目前慢病毒載體介導的基因轉移方法在安全性、甲基化沉默和定點整合方面還有待于進一步改進。若將慢病毒載體與上述轉基因技術聯合應用對尋找和探索高效、經濟、便捷的轉基因的新技術和新方法有著重要的意義。過去轉基因的目的主要通過兩種途徑，一是直接轉入外源基因過量表達，如生物反應器；二是同源重組敲除（knock-out）靶基因，如疾病動物模型和器官移植，但完全敲除某個功能基因，在有些情況下可能會引發了一系列新的機能紊亂。將目標基因的功能只是部分調控（knockdown），在改變動物的某些重要性狀方面將會有重要的作用。近年來一系列研究表明，動物的生長發育是由一系列復雜、多層次的基因表達網絡所調控。與基因敲除相比，將靶基因的功能只是部分下調，既可以維持動物生長發育調控網絡整體性，又可以改變動物的某些重要性狀，所以該項技術在轉基因動物育種方面將會有重要的作用。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）技術是近年來發展起來的一種新型轉基因打靶技術,是目前部分調控目的基因表達的有效方法。RNAi技術是建立在非編碼小分子RNA如miRNA(microRNA)和siRNA（smallinterferingRNA）對基因表達特異性調節的基礎上。這種調節活動通過下調目的基因的表達，影響動物的各種發育和生理過程，如細胞分化、組織和器官發育、內分泌、新陳代謝、免疫應答以及疾病的發生等。短發夾RNA(ShorthairpinRNA，shRNA)是一種人工設計的RNA分子，可以在細胞內加工成siRNA來發揮作用?？梢酝ㄟ^構建載體來表達目的基因的RNA干涉分子，并通過siRNA和miRNA途徑下調目的基因的表達。目前通過慢病毒載體和RNA干涉技術聯合介導轉基因動物的生產已經在大鼠、小鼠、羊，尤其在豬上有成功的報道。1.3本研究的思路本研究選擇在動物生長調控中起重要作用的負調節因子-生長抑素（SS）作為靶基因，制備最優RNAi效應的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長的優良轉基因動物，為畜牧業動物育種改良可提供良好的經濟利益和社會效益，也為這項技術早日進入實際應用打下基礎，并可為研究動物生長調控提供有益的動物模型。在方法上創新性為動物整體水平上緘默SS基因表達提供優良RNAi效應的shRNA序列；在思路上前沿性提出利用慢病毒載體與RNAi技術相結合廉價，為快速生產SS基因部分緘默的轉基因動物模型奠定一定的實驗基礎。2實驗材料主要質粒與試劑：限制性內切酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶DNAMarker、dNTPs以及RibonucleaseInhibitor等均購自大連TaKaRa公司。大腸桿菌DH5α、pcDNA3.1(-)質粒均由本室保存；NIH3T3細胞株為本室保存。pshRNA-copGFPLentivector穿梭質粒、慢病毒包裝系統pPACKLentivectorPackagingSystem，該系統為四質粒共轉染法即一個穿梭質粒，三個包裝質粒pPackA(pREV)、pPackB(pVsv-g)及pPackC(pGag-pol)從上海倍尼菲生物科技有限公司購得。3實驗方法3.1生長抑素（SS）基因siRNA的設計根據GenBank上的豬的SS基因mRNA的序列（序列號：NM_001009583）設計SS的siRNA。設計原則為：從起始密碼AUG下游50～100nt開始，避開5’端或3’端的UTRs，搜索AA（N19）序列；有義鏈1位為G或C，19位為A或U，雙鏈5’端能量應該比3’端高，即有義鏈15～19至少有3個A或U，或者13～19至少有5個A或U；siRNA5’端必須磷酸化，3’端懸垂兩個dTdT，或是UU；選擇GC含量在30%～50%的siRNA，亦有報道GC含量不宜超過36.8%；16位最好為C，13位最好為非G；避免超過三個G或三個C重疊，多聚G或多聚C序列能產生堆積形成類聚物而干擾沉默機制；使用BLAST(/BLAST/)將潛在的靶序列和相應的豬的基因組數據庫進行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列；由于RNApolⅢ啟動子的轉錄終止信號是連續的6個“T”的多聚核苷酸，因此，應避免在靶序列中存在≥4個“T”靶序列1（siRNA1）：5’-AAGACTTTCACATCCTGTTAG-3’靶序列2（siRNA2）：53.2發夾SS-siRNA轉錄模板寡核苷酸的設計與合成按照pshRNA-copGFPLentivector的說明進行設計與合成，圖1是如何將siRNA靶序列轉換成為轉錄模板寡核苷酸序列的程序示意圖。兩個反向互補排列的19nt特異性靶序列由一個12nt（5’-CTTCCTGTCAGA-3’）的loop相連接，形成莖環的發夾結構。轉錄模板兩端分別為BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，并以5個T作為RNApolⅢ的轉錄終止子。分別合成發夾siRNA轉錄模板的兩條相應的圖1發夾siRNA轉錄模板的設計shRNA-DNA合成片段信息：siRNA1-f：5’-GATCCGACTTTCACATCCTGTTAGTTCAAGAGACTAACAGGATGTGAAAGTCTTTTTTG-3’5’-AATTCAAAAAAGACTTTCACATCCTGTTAGTCTCTTGAACTAACAGGATGTGAAAGTCG-3siRNA2-f：5’-GATCCGAATTTCTTCTGGAAGACTAGAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTTTTTG-3siRNA2-r：5’-AATTCAAAAAATCTCTTGAAAGTCTTCCAGAAGAAATTCG-3’同時模板鏈兩端分別設計酶切位點為BamHⅠ和EcoRⅠ，由上海吉凱基因技術有限公司合成。3.3SS-siRNA表達載體的構建及鑒定圖2為pshRNA-copGFPLentivector載體圖，此載體帶有H1RNApolⅢ啟動子（3761bp～3977bp）及哺乳動物熒光篩選標記copGFP（2279bp～3037bp）。圖2pshRNA-copGFPLentivector載體圖1.退火，溶解轉錄模板DNA，稀釋至濃度為1μg/μL，準備退火溶液。單鏈各1μg混合于10×退火溶液中，90℃1~3min,37℃1h，得到轉錄模板雙鏈DNA插入片段，濃度為10ng/μL，2.載體pshRNA-copGFP質粒通過BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，37℃酶切過夜。1%瓊脂糖凝膠電泳，博大泰克凝膠片斷回收純化試劑盒回收載體片段。3.將shRNA-DNA退火產物與雙切pshRNA-copGFPLentivector 載體連接，16℃水浴連接，反應過夜。4.轉化。取連接反應產物（設陰性對照質粒）加入到適量E.coli(DH5α)感受態細胞中，CaCl2法轉化。Amp(50μg/mL)篩選。5.陽性菌落的PCR擴增。挑取樣品陽性單菌落，使用多克隆位點兩端的引物進行PCR擴增檢測陽性菌落。其中Fprimer：5’-AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’、Rprimer：5’-TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTA-3’。PCR反應條件如下：94℃10分鐘，94℃30秒,55℃30秒，72℃30秒。反應進行33個循環，產物在6.使用PCR產物5μL上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；7.若電泳片段大小正確，則挑取陽性菌落于3mLLB液體培養基中，37℃8.提取質粒，使用載體上的引物（F/Rprimer）將質粒DNA送測序，比對測試結果與設計DNA的序列是否一致。圖3pcDNA3.1(+/-)載體圖Fig.3pcDNA3.1(+/-)VectorMap3.4真核表達載體pcDNA3.1-SST圖3pcDNA3.1(+/-)載體圖Fig.3pcDNA3.1(+/-)VectorMap1、SST-cDNA的擴增根據SST基因序列設計引物，擴增SST包含編碼區和3’上游引物：5’-GGAATTCATGCTGTCCTGCCGCCTEcoRI下游引物：5’-CCCAAGCTTCTAACAGGATGTGAAAGHindIII以豬的下丘腦提取RNA反轉錄產物為模板，引物為SST的上下游引物，擴增的目的片段為351bp。PCR反應采用50μL反應體系。體系的組成為：10×PCR緩沖液5μL，2.6mmol/LdNTP4μL，上游引物（10pmol/μL）1μL，下游引物（10pmol/μL）1μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，補加ddH2O至50μL。按以下條件進行PCR反應：94℃，2min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，3min，共35個循環，然后2、目的基因SSTPCR產物的純化將剩余的PCR產物，用試劑盒純化PCR產物，具體操作按試劑盒說明進行。3、SST克隆到pMD18-T載體將上述純化的片段作為插入片段，連接到pMD18-T載體上。連接反應體系：PCR產物6μL，2×LigationBuffer7.5μL，T4DNALigase1μL，pMD18-TVector0.5μL，總體積15.0μL。室溫作用1h。連接產物命名為T-SST。將連接產物轉化DH5α感受態菌，然后進行重組質粒的提取與鑒定。利用生物分析軟件DNAMAN進行同源性分析。4、pcDNA3.1-SST載體構建EcoRI與HindⅢ雙酶切pcDNA3.1(-)，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收載體大片段5kb左右片段。酶切T-SST，回收SST片段，然后進行SST目的片段與pcDNA3.1(-)大片段的連接與轉化。用試劑盒提取重組質粒，進行酶切鑒定并測序，條件同前。3.5RNA干擾有效靶點的篩選1、三種表達質粒轉染真核細胞將pcDNA3.1-SS分別和LV-siRNA1、LV-siRNA2共轉染入NIH3T3細胞進行表達。設pcDNA3.1-SS單獨轉染和空細胞對照，每個處理設3個重復。其中pcDNA3.1-SS與慢病毒干擾質粒的比例為1：6。脂質體轉染，按照LipofectamineTM2000試劑說明書進行。轉染后48h，部分細胞用Trizol收集（一般用6孔培養板），-7048h收集轉染細胞并計數，細胞用0.25%的胰酶消化細胞，離心1000r/min，5min，沉淀加入200μL細胞裂解液劇烈震蕩，裂解細胞，離心1000r/min，5min，上清-702、RIA檢測參照試劑盒說明書，采用RIA方法測定，檢測轉染細胞裂解液中SST的濃度。操作步驟詳見說明書。3、數據處理數據采用SAS9.0軟件進行統計分析，數值用平均值±標準誤(mean±S.E.)表示。對同一品種的數值進行單因素方差分析(one-wayANOVA)，并進行鄧肯氏多重比較(Duncan’smultiplerangetest)；P<0.05為差異顯著。3.6病毒包裝293T細胞的培養1、細胞的凍存取生長旺盛的細胞并鋪滿培養瓶的90%，用0.05%胰酶消化至細胞變圓、即將漂浮時，加至少10倍體積的含有10%的FBS的培養液中止反應，800r/min離心5min，無菌吸管吸棄液體，加入完全培養基制成細胞懸液(細胞濃度應=1×106細胞/mL)，加入終濃度為10%的DMSO，用凍存管分裝，4℃1h，-20℃2h，-702、細胞的復蘇從液氮罐中取出細胞凍存管，應帶防護手套。迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不時搖動，盡快解凍。用70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺上，吸出細胞懸液至離心管中，加入10mLD-MEM洗滌，800r/min離心5min，棄上清。將沉淀用含10％胎牛血清的D-MEM懸浮后轉移至培養瓶中，37℃、5%CO3、細胞的傳代(1)待貼壁細胞長滿單層，吸棄培養基，加入滅菌PBS溶液，輕輕晃動，洗滌細胞生長面，然后棄去PBS溶液。(2)加入0.25%胰酶進行消化，待倒置顯微鏡下觀察細胞已收縮變圓時，加入含10%胎牛血清的D-MEM終止反應，用吸管輕輕吹打成細胞懸液，并將其分裝于2個培養瓶中，即完成1次傳代。4、高純度無內毒素質粒制備使用EndoFree?PlasmidMaxiKit制備無內毒素LV-siRNA1及三個包裝質粒pPackA、pPackB及pPackC，質粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之間。5、高純度無內毒素質粒制備使用EndoFree?PlasmidMaxiKit制備無內毒素LV-siRNA1及三個包裝質粒pPackA、pPackB及pPackC，質粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之間。6、質粒的定量將各次大量制備的質粒DNA在GeneQuant上進行定量。具體方法是：將質粒進行100、200、400倍比稀釋，用ddH2O作空白對照，分別測定三次取平均值，讀取樣品的dsDNA濃度，然后計算出dsDNA的量。7、慢病毒的包裝（1）細胞的轉染：A.轉染前2-3天，用含有滅活的血清和抗生素的D-MEM培養基培養293T細胞株。轉染前一天，在新的10cm的培養皿中接種5×106293T細胞，完全吹散細胞以保證細胞均勻的分布。當轉染時細胞最好鋪滿培養皿的50-70％。B.將2μg（體積最好在2-25μL之間）帶有目的基因的慢病毒表達載體同20μL（10μg）pPACK包裝質粒混合物混合，用400μL不含血清和抗生素的D-MEM培養基稀釋質粒，混勻，室溫孵育15分鐘。C.用400μL不含血清和抗生素的D-MEM培養基稀釋30μLLipofectamine2000TM試劑，輕微混勻。D.將稀釋的Lipofectamine2000TM試劑逐滴加入到DNA/D-MEM混合液中，輕輕地上下顛倒混勻，室溫孵育15分鐘。E.在第4步孵育形成轉染混合物的同時，用10mL不含血清和抗生素的D-MEM洗293T細胞一次，然后加入9mL含2％血清不含抗生素的D-MEM培養基。F.將第4步中產生的DNA/Lipofectamine2000TM試劑混合物加入第5步中處理的培養皿中，輕輕地將混合物和培養基混勻，CO2培養箱中37℃培養過夜。G.用新鮮的含2％血清和抗生素的D-MEM培養基替換掉含有轉染混合物的培養基，CO2注意：觀察培養基的顏色。培養24小時后和48小時后，如果由于293T細胞很高的代謝活性引起培養基顏色變黃（呈酸性）的話，則分別收集這兩個時間點的上清。通常產生病毒的高峰出現在48小時。用含2％血清不含抗生素的D-MEM培養基替換掉上清液。（2）病毒的收獲：收集轉染后48小時的293T細胞上清液。于4℃，4000rpm/min離心10分鐘，除去細胞碎片。然后將上清液用0.45μm的PVDF濾膜過濾（低蛋白結合能力的濾膜）。病毒液可以直接-804實驗結果4.1靶向SSmRNA的siRNA序列設計借助互聯網上IrisGenetics的軟件程序siRNADNADesigner1.3設計靶向SSmRNA（序列號：NM_001009583）的siRNA序列，依據Tuschl等關于siRNA的設計原則，將設計出的序列利用BLAST和相應的基因組數據庫進行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列。最終選擇以下序列作為siRNA靶序列，記作S（GC含量為33.3%）。316bp:AAGAATTTCTTCTGGAAGACT4.2SS-siRNA轉錄模板寡核苷酸的設計及合成將siRNA設計成相應的表達發夾shRNA的DNA單鏈模板，兩端分別為BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點，合成1對發夾shRNA轉錄模板的DNA單鏈，由上海倍尼菲生物科技有限公司合成，序列如下：5'-GATCCGAATTTCTTCTGGAAGACTCTTCCTGTCAGAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTTTTG-3'3'-GCTTAAAGAAGACCTTCTGAGAAGGACAGTCTTCAGAAGGTCTTCTTTAAGAAAAACTTAA-3'4.3SS-siRNA轉錄模板表達重組質粒的構建及鑒定退火產物與線性LV-shRNA-GFP載體連接，轉化，每個片段挑5個菌落，將PCR反應產物進行電泳檢測。將電泳的結果與陰性對照（空載體）比較，目的條帶與設計相符，挑選陽性克隆進行測序。LV-siRNA1干擾質粒PCR目的產物電泳結果如圖4，LV-siRNA2干擾質粒PCR目的產物電泳結果如圖5。123456123456M123456圖4LV圖4LV-siRNA1PCR鑒定1-2:陰性對照;3:H2O;4:空質粒對照;5-6:陽性克隆;M:DL2000Marker圖5LV-siRNA2PCR鑒定1:H2O;2:空質粒對照;3、5-6:陰性對照;4:陽性克隆;M:DL2000Marker重組質粒菌液鑒定擴增出的基因片段大小與理論（156bp）相符。LV-siRNA1和LV-siRNA2測序結果與原設計的完全相同，沒有基因突變。證明已成功構建了兩個慢病毒干擾質粒。4.4真核表達載體pcDNA3.1-SST4.4.1SST基因達到獲得M123提取豬下丘腦組織總RNA（圖6），RT-PCR擴增得到SST前體cDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳在250bp-500bp處可見條帶，與理論值相符（351bp）（圖7）。M12328s28s18s圖6豬下丘腦組織總RNA圖7RT-PCR擴增SST圖7RT-PCR擴增SSTM:DL2000Marker;1-3:SST目的基因4.4.2重組質粒pcDNA3.1-SST的構建與鑒定以下丘腦組織總RNA反轉錄產物為模板進行PCR擴增，獲得SST基因片段并在兩端添加了EcoRI和HindIII。膠回收下丘腦組織RT-PCR產物，方法詳見說明書。SST基因片段回收產物連接pMD18-TVector，構建重組質粒T-SST，其酶切和PCR鑒定結果分別如圖8。M134M2M134M2bM112a圖8T-SSTPCR和酶切鑒定圖8T-SSTPCR和酶切鑒定a:SSTPCR;b:SST酶切M1:DL2000Marker;M2:λ-EcoT14ⅠMarker;1-2:PCR產物;3-4:質粒雙酶切由上圖可以看出在250bp-500bp處有目的帶出現，大小與理論（351bp）相符。DNAMAN軟件分析測序結果表明，T-SST中插入DNA的序列與設計序列同源性為100％，說明獲得了序列正確的SST基因片段。重組質粒pcDNA-SSPCR鑒定結果分別見圖2-7，擴增出的基因片段大小與理論（351bp）相符，其雙酶切鑒定結果見圖2-8。通過PCR和酶切鑒定以及序列鑒定，證明已成功構建了pcDNA-SS真核表達載體。4.4.3RIA檢測結果RIA檢測細胞裂解液中SST含量結果見圖9圖9轉染圖9轉染NIH3T3細胞裂解液中SST的濃度1:pcDNA3.1-SS與LV-siRNA1共轉染;2:pcDNA3.1-SS與LV-siRNA1共轉染;3:pcDNA3.1-SS單獨轉染;4:空白組由圖1-9可知，陰性對照組即沒轉染質粒的細胞不表達SST。與第3組相比，第1和2組的SST濃度極顯著降低即pcDNA3.1-SS與干擾質粒的比例為1：6(P<0.01)，第1組和第2組之間差異不顯著(P>0.05)，但第1組SST濃度比第2組有所降低。綜合以上確定LV-siRNA1慢病毒干擾質粒的干擾效果較好，用于后續的試驗。4.5病毒的包裝慢病毒的包裝采用四質粒系統共轉293T的方法，共轉的質粒分別在293T中表達各種病毒蛋白，與含識別信號的轉移載體結合裝配后形成假病毒顆粒，胞吐到培養基。圖10顯示共轉染293T轉染效率。baba圖圖10慢病毒四質粒系統共轉染293T(10×)a:熒光觀察;b:白光觀察慢病毒載體四質粒系統共轉染293T細胞，在細胞內病毒蛋白裝配成含轉移載體的病毒，由圖3.1可知熒光顯微鏡下觀察到熒光的高表達，說明四質粒系統高效的轉染了293T細胞，保證了病毒包裝的效率。4.6慢病毒滴度的測定慢病毒不同稀釋倍數感染293T后熒光的表達情況如圖11，結合圖并由公式計算出本試驗包裝的病毒滴度為5×104ifu/ml。超速離心后病毒滴度達到5×109ifu/mlcbacbafedfed圖圖11慢病毒滴度測定不同稀釋倍數下細胞感染的狀況(10×)a:病毒稀釋倍數10e0;b:病毒稀釋倍數10el;c:病毒稀釋倍數10e2;d:病毒稀釋倍數10e3;e:病毒稀釋倍數10e4;f:空白細胞5討論5.1靶基因siRNA的設計siRNA是一種基于核酸的靶向抑制基因表達的分子，具有特異性和靶向性的特點。對于大多數基因來說，細胞質內發生的靶向mRNA的抑制作用足以下調目的基因的表達。siRNA能夠在低濃度的情況下實現基因沉默，效果比以有報道的反義寡核苷酸、核酶和脫氧核酶都好，因此，siRNA是最有效的反義分子。RNAi成功的關鍵是siRNA作用靶序列的設計選擇，即如何從SS的mRNA序列中找到siRNA的最佳靶位點是必須首先考慮的問題。我們利用網站檢索并排除了和其他基因明顯同源的靶序列。siRNA的干涉效率直接關系到基因治療的效果，目前關于siRNA干涉效率的研究主要集中在兩個方面：一方面研究siRNA的特點，強調siRNA雙鏈的熱力學結構是高效沉默的先決條件；另一方面研究siRNA所識別的靶序列的特征，認為siRNA的抑制效果與其所識別靶序列的結構有關。RNAi雖然具有很強的基因沉默能力，但識別同一靶mRNA的不同序列的siRNA的干擾效果卻不盡相同。得到高效的siRNA是利用RNAi基因功能和表達調控研究的基礎。有研究指出，在哺乳動物細胞中，siRNA的干涉效果除了受自身的結構和功能特點影響外最終要的決定因素是其識別的靶mRNA的局部結構特征。也就是說，盡管siRNA序列是實現RNA干涉的基礎，但其識別的靶序列局部復雜的結構直接影響siRNA的干涉效率。因此我們將全長315bp的SSmRNA序列進行了二級結構的模擬，結合局部二級結構分析選擇位于mRNA莖環處的siRNA最佳靶位點。5.2慢病毒載體的安全性慢病毒作為外源基因轉移的載體已經被廣泛應用，慢病毒的制備可能會伴隨著可復制病毒(RCV)的產生。人們通過刪除或失活一些非必需元件如輔助基因來提高慢病毒載體的安全性。在此基礎上HIV-1載體系統發展經歷了3個階段。本研究所使用的是四質粒系統，是一種自我失活的慢病毒載體，即整合入宿主的基因后停止復制自我序列，是改進后的第三代產品，其生物安全性得了很大的提高。(1)表達質粒的3′LTR(△U3)缺失，這種處理不會影響宿主細胞內病毒基因組的生成，但是可以在病毒轉化入宿主細胞后發生“自我滅活”。一旦整合入宿主細胞，病毒基因組就不再具備產生可包裝的病毒基因組的能力。(2)用VSV-G代替HIV-1的包膜蛋白。(3)編碼結構蛋白和包裝病毒基因組所需成分的基因被分成4個部分，每一部分之間都沒有同源序列，避免產生具有復制能力的病毒。(4)盡管3個包裝質粒在293FT細胞中均可表達并形成產物蛋白，但它們都不含有LTRs或Ψ包裝序列。這意味著并沒有真正的HIV-1結構基因在包裝好的病毒基因組中出現，也就不會在轉化的宿主細胞中表達，不會產生新的具有復制能力的病毒。(5)包裝產生的慢病毒顆粒沒有復制能力，只含有目的基因。(6)由于HIV-1的RRE存在于gag/pol的mRNA副本中，致使pLP1中gag和pol的基因表達是Rev依賴性的。在缺乏Rev的情況下加入RRE可防止gag和pol的表達。5.3慢病毒的滴度病毒的滴度是進行后續研究特別是動物試驗的重要條件。病毒產物一般凍存于-80℃6結論1、在長度為351bp的豬生長抑素mRNA序列中選擇并設計了兩條siRNA，并構建了表達發卡siRNA的慢病毒干擾質粒（簡稱LV-siRNA1和LV-siRNA2）。2、構建了豬生長抑素基因真核表達載體pcDNA3.1-SS。3、將慢病毒干擾質粒與pcDNA3.1-SS分別共轉染細胞株，通過RIA檢測轉染細胞裂解液中SS濃度，證明2條siRNA對SST基因表達均有不同程度的抑制作用，其抑制率分別為87.9%和86.3%，而且LV-siRNA1干擾效率較好。4、本試驗利用慢病毒四質粒系統成功包裝出假病毒顆粒，經測定病毒原液的滴度達到5×104ifu/ml，超速離心后病毒滴度為5×109ifu/ml。【參考文獻】[1]DannC.T.,AlvaradoA.L.,HammerR.E.,GarbersD.L.Heritableandstablegeneknockdowninrats.ProcNatlAcadSciUSA.2006,103(30):11246–11251.[2]DieckhoffB.,KarlasA.,HofmannA.,KuesW.A.,etal.Inhibitionofporcineendogenousretroviruses(PERVs)inprimaryporcinecellsbyRNAinterferenceusinglentiviralvectors.ArchVirol2006,inpress.[3]DieckhoffB,PetersenB,KuesWA.,KurthR,NiemannH,DennerJ.Knockdownofporcineendogenousretrovirus(PERV)expressionbyPERV-specificshRNAintransgenicpigs.Xenotransplantation.2008;15:36-45.[4]GoldingM.C.,LongC.R.,CarmellM.A.,HannonG.J.WesthusinME.SuppressionofprionproteininlivestockbyRNAinterference.ProcNatlAcadSciUSA.2006,103(14):5285-90.[5]HamraF.K.,GatlinJ.,ChapmanK.M.,GrellheslD.M.,GarciaJ.V.,HammerR.E.,GarbersD.L.Productionoftransgenicratsbylentiviraltransductionofmalegerm-linestemcells.ProcNatlAcadSciUSA.2002;99:14931-6.[6]HofmannA.,KesslerB.,EwerlingS.,etal.,EpigeneticRegulationofLentiviralTransgeneVectorsinaLargeAnimalModel.MOLECULARTHERAPY.2006.13(1)：59-66.[7]LavitranoM,CamaioniA,FazioVM,DolciS,FaraceMG,SpadaforaC.SpermcellsasvectorsforintroducingforeignDNAintoeggs:genetictransformationofmice.Cell1989;57:717–23.[8]LenzG.TheRNAinterferencerevolution.JMedBiolRes2005,38(12):1749-1757.[9]LoisC.,HongE.J.,PeaseS.,etal.GermlineTansmissionandTissue-SpecificExpressionofTransgenesDeliveredbyLentiviralVectors.Science,2002,295:868-872.[10]MichalkiewiczM.,MichalkiewiczT.,GeurtsA.M.,RomanR.J.,SlocumG.R.,SingerO.,WeihrauchD.,GreeneA.S.andCowleyJrA.W.Efficienttransgenicratproductionbyalentiviralvector.JPhysiolHeartCircPhysiol.2007,doi:10.1152/ajpheart.00060.2007.[11]NaganoM,WatsonDJ,RyuBY,WolfeJH,BrinsterRL.Lentiviralvectortransductionofmalegermlinestemcellsinmice.FEBSLett.2002,524:111-115.[12]NaldiniL.LentivirusesasGeneTransferAgentsforDeliverytoNon-dividingCells.Curr.Opin.Biotechnol.1998,9,457-463.[13]NishitsujiH.,IkedaT.,MiyoshiH.,OhashiT.,KannagiM.,MasudaT.ExpressionofsmallhairpinRNAbylentivirus-basedvectorconfersefficientandstablegene-suppressionofHIV-1onhumancellsincludingprimarynon-dividingcells.MicrobesandInfection.2004,6,76–85.[14]RamakrishnanVG，AljamaliMN，SauerJR，etal．2005．ApplicationofRNAinterferencei