川西獐牙菜醇提物對(duì)HepG2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3、BSEP表達(dá)的影響研究背景及目的：膽汁酸具有重要的生理功能，可參與多種物質(zhì)的運(yùn)輸代謝，但同時(shí)膽汁酸也是膽汁淤積情況下導(dǎo)致機(jī)體損傷的原因。肝內(nèi)膽汁酸大量的異常聚集，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷是膽汁淤積的主要發(fā)病機(jī)制。生理情況下，多種肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與肝內(nèi)膽汁酸穩(wěn)態(tài)的精密調(diào)節(jié)，主要包括：分布于基底側(cè)膜面如MRP3、MRP4等，膽管膜面如BSEP、MRP2等。多藥耐藥相關(guān)蛋3(multidrugresistanceprotein3,MRP3)是具有ATP結(jié)合域的MRPs(multidrugresistance-assocatedprotein)超家族中的一員,是位于肝細(xì)胞基底外側(cè)膜面最重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MRP3主要的生理功能是轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)陰離子，如二價(jià)膽汁酸(葡萄糖醛化和硫酸化的膽汁酸)、GSH(還原型谷胱甘肽)和某些藥物。生理狀態(tài)下肝臟中MRP3不表達(dá)或低表達(dá)，但在膽道結(jié)扎和LPS誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠模型中，MRP3代償性增高，有利于膽汁酸、膽紅素等毒性物質(zhì)及時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)出肝細(xì)胞。膽鹽輸出泵(bilesaltexportpump，BSEP)屬ABC(ATP-bindingcassette)家族蛋白，是位于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管面的重要膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要功能是介導(dǎo)膽汁鹽依賴性的膽汁流動(dòng)，能將各種一價(jià)膽汁酸如牛磺膽酸和初級(jí)膽汁酸如鵝去氧膽酸等從肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到毛細(xì)膽管中。BSEP基因缺陷可導(dǎo)致多種臨床疾病的發(fā)生，如妊娠肝內(nèi)膽汁淤積病、膽囊膽固醇結(jié)石和Ⅱ型家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥等。多種核受體/核轉(zhuǎn)錄因子參與了MRP3和BSEP基因的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。多個(gè)藥物如利福平、熊去氧膽酸(ursodeoxycholicacid，UDCA)和苯巴比妥等可作為核受體的配體直接激活核受體或者與核受體的配體結(jié)合間接調(diào)控核受體的表達(dá)。研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子SP1(specificityprotein1transcriptionfactor，SP1)及核受體孕烷X受體(pregnaneXreceptor，PXR)、CYP7A啟動(dòng)子結(jié)合因子(CYP7Apromoter-bindingfactor，CPF)均與MRP3的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。而B(niǎo)SEP的表達(dá)調(diào)控與RXRα密切相關(guān)，RXRα不僅可直接作為BSEP的配體上調(diào)BSEP的表達(dá)，也可與其他核受體形成異二聚體，間接起作用。如FXR可誘導(dǎo)BSEP表達(dá)，RXRα可作為配體與FXR形成異二聚體，催化FXR對(duì)BSEP的調(diào)控作用，顯著提高FXR對(duì)BSEP的刺激效用，提高FXR的工作效率。目前臨床上可有效治療淤膽的藥物十分有限，熊去氧膽酸雖被廣泛使用，但也存在療效個(gè)體差異大、總體療效不理想、副作用較大等缺點(diǎn)。因此，現(xiàn)今急需解決的問(wèn)題是尋求一種更有效、更安全的治療膽汁淤積的藥物。川西獐牙菜(swertiamussitiifranch)是生長(zhǎng)于高原地區(qū)的珍貴中藥，系獐牙菜屬，龍膽科植物。藏醫(yī)里常常單方治療肝臟和膽囊疾病，臨床上多可用于治療急、慢性黃疸性肝炎，但其作用機(jī)制還不十分明確。本研究的重點(diǎn)是川西獐牙菜能否調(diào)控細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3和BSEP的表達(dá)，且何種核受體參與其調(diào)控，從而探討其對(duì)治療膽汁淤積的效果和機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)川西獐牙菜醇提物體外刺激HepG2細(xì)胞，觀測(cè)其對(duì)MRP3和BSEP在mRNA和蛋白水平的影響，并觀測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子SP1和核受體CPF、PXR、RXRα的變化狀況。目的是為治療膽汁淤積的臨床用藥提供理論依據(jù)。研究方法：1.不同終濃度的川西獐牙菜醇提物體外刺激HepG2細(xì)胞，運(yùn)用MTT法檢測(cè)不同濃度藥物對(duì)HepG2細(xì)胞生存率影響。目的是尋找對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖影響最小的濃度，即為最佳作用濃度。2.選用最佳濃度川西獐牙菜醇提物于不同時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h、48h、72h)體外刺激HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立DMSO處理組為陰性對(duì)照，UDCA處理組為陽(yáng)性對(duì)照組。RT-PCR檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3、BSEP，核轉(zhuǎn)錄因子SP1及核受體PXR、CPF、RXRαmRNA表達(dá)的變化情況；Westernblot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3、BSEP、核轉(zhuǎn)錄因子SP1及核受體PXR、CPF、RXRα蛋白表達(dá)的變化情況。結(jié)果：1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為25～50uM的川西獐牙菜醇提物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)明顯影響。2.RT-PCR結(jié)果顯示：同DMSO組相比，藥物刺激后HepG2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3mRNA水平表達(dá)增高，但對(duì)BSEP作用不明顯，可能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)起作用，同時(shí)上調(diào)相關(guān)核受體PXR、CPF、RXRαmRNA的表達(dá)(P<0.05)。3.Westernblot結(jié)果表明：與陰性對(duì)照組相比，藥物處理組可明顯促進(jìn)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3、BSEP及相關(guān)核受體PXR、CPF、RXRα蛋白的表達(dá)(P<0.05)。其中，對(duì)MRP3、BSEP蛋白水平的上調(diào)作用均強(qiáng)于UDCA處理組(P<0.05)。結(jié)論：1．川西獐牙菜醇提物可刺激HepG2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3mRNA和蛋白水平的表達(dá)，且其表達(dá)增高可能與核轉(zhuǎn)錄因子SP1及核受體