人工栽培羊肚菌的鑒定王波;鮮靈【摘要】羊肚菌人工栽培已成功，但栽培的羊肚菌分類地位不明確.本文對人工栽培的羊肚菌進行了形態特征描述和ITSrDNA序列分析.結果表明，人工栽培羊肚菌為梯紋羊肚菌Morchellaimportuna,運用分子生物學技術進行鑒定,并與GenBank中下載的羊肚菌屬種建立了系統發育樹.【期刊名稱】《西南農業學報》【年(卷)，期】2013(026)005【總頁數】4頁(P1988-1991)【關鍵詞】梯紋羊肚菌;形態特征;rDNAITS;系統發育【作者】王波鮮靈【作者單位】四川省農業科學院土壤肥料研究所,四川成都610066;四川省農業科學院土壤肥料研究所,四川成都610066【正文語種】中文【中圖分類】S626羊肚菌類大多數為美味食用菌，是全球六大最珍貴食用菌之一，在歐洲，被認為是僅次于黑孢塊菌的美味食用菌；在北美，被認為是最佳食用菌［1］，羊肚菌是我國重要出口食用菌產品。世界上記載有28個種［2］,其中我國記載羊肚菌屬有11個種，分別為黑脈羊肚菌MorchellaangusticeosPeck，脈肋羊肚菌M.costata(Vent.)Pers.，粗腿羊肚菌M.crassipes，小羊肚菌M.deliciosaFr.，高羊肚菌M.elataFr.，高羊肚菌紫褐變種M.elatavar.purpurasensKrombh.(=M.purpurascens(Krombh.exBoud.)Jacquet.)，羊肚菌M.esculenta(L.)Pers.(=M.rotunda(Fr.)Boud.，羊肚菌堅挺變種M.esculentavar.rigida(Krombh.)I.R.Halletal.，羊肚菌褐赭色變種M.esculentaar.umbrina(Boud.)S.Imai(=M.umbrinaBoud.)，薄棱羊肚菌M.miyabeanaS.Imai，普通羊肚菌M.vulgaris(Pers.)Boud.(=M.conicaPers.)等［3］。有關羊肚菌的人工栽培成功報道距今有100多年歷史。我國和美國均人工栽培成功羊肚菌，美國利用工廠進行了栽培；我國在田間栽培成功出羊肚菌，云南是利用段木栽培羊肚菌［4］，而四川是利用耕地栽培羊肚菌；我國人工在栽培的羊肚菌屬種有尖頂羊肚菌［5~6］，羊肚菌等，由于未見形態特征和分子標記鑒定證據，人工栽培的羊肚菌是何種？有必要鑒定出其種名。羊肚菌的鑒定方法有形態學和分子標記鑒定，由于人工栽培羊肚菌屬種的子囊果形態特征與野生的存在差異，人工栽培的羊肚菌屬種有的個體大、有圓形、錐形等，僅從形態特征上是難以準確鑒定的，還需以分子標記進行輔助鑒定，在分子標記鑒定上已開展了大量的研究，利用ITSrDNA序列鑒定的較多，建立了羊肚菌屬種的系統發育樹［7~8］，對我國羊肚菌系統發育研究表明，發現中國有30種羊肚菌，其中有20個為本地種，9個種在歐洲也有分布，4個種可能是火燒適應種［9］;為了快速鑒定出羊肚菌物種，建立了網絡參考數據庫［10］。1材料與方法1.1材料來源鑒定的樣品分別來自崇州市、郫縣、大邑縣、涪城區等地的人工栽培的〃羊肚菌”子囊果，編號分別為WB201、WB202、WB203、WB204。標本保藏在四川省農業科學院土壤巴料研究所。1.2形態特征鑒定方法對羊肚菌子實體進行了子實體的外觀形態和顯微形態特征觀察，紀錄形態特征。1.3分子標記鑒定方法1.3.1基因組DNA提取方法以鮮子實體為材料，利用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。1.3.2ITS序列分析采用真菌通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)。反應體系為50pl，該體系包括2xPCRMasterMix25Ml,Primer(0.2pmol/L)各1.5pl;模板DNA1pl,加ddH2O補齊50pl。在BioRadMyCycle型PCR儀上擴增，PCR程序設定:94°C,3min(預變性);94^變性1min,54°C下退火lmin,72°C延伸2min;共計35個循環；循環結束后在72°C延伸8min。1.3.3測序將ITS-PCR產物進行純化，操作方法依試劑盒的操作手冊進行，純化后的PCR擴增產物和引物直接測序，測序由上海英俊生物技術有限公司完成。1.3.4ITS序列分析根據文獻報道的羊肚菌屬種［10］，從GenBank數據庫中下載羊肚菌屬12個種的ITS序列，將所測序列與從GenBank中下載羊肚菌屬種類序列進行比對后，使用Mega4.0軟件中NJ法構建系統發育關系樹。2結果與分析2.1子實體形態特征對采集紙四川大邑縣、崇州市、郫縣和涪城區的人工栽培的羊肚菌進行了形態特征描述，4個地區采集的羊肚菌在子實體形態特征上無明顯區別，子實體菌蓋為灰黑色、錐形，縱棱縱向排列，較規則，橫棱不規則，縱棱和橫棱交接形成似梯子狀橫隔，凹坑深，菌蓋長8.2~10.5cm，直徑2.0~2.8cm;菌蓋與菌柄離生，菌蓋中空，菌柄柱狀，菌柄稍膨大，中空，白色，菌柄長度3.7~4.0cm，直徑1.0~1.3cm。子囊棒狀，無色，每個子囊內有8個子囊孢子，縱向或重疊排列，大小為162-200|jmx16.2~20.0pm;側絲棒狀，頂端膨大，大小為80.01-112.5|jmx7.5~10.0pm;子囊孢子橢圓形，無色，大小為10~16pmx7.5~12.5pm（圖1）。2.2ITS擴增對4個羊肚菌屬種樣品進行基因組DNA提取后，通過ITS4、ITS5引物進行PCR擴增，擴增產物進行電泳檢驗，通過DNAMarker（DL2000）分子量估算，檢測的羊肚菌屬種4個樣品的ITS條帶在750bp左右（圖2）。圖1人工栽培羊肚菌子囊果形態特彳正Fig.1MorphologicalcharacteristicsofthecultivatedMorchellaascocarpA:子囊果生長情況；B:子囊果形態特征；C:側絲；D:子囊孢子；E:子囊A:Growthsituationofascocarp;B:macromorphologicalfeaturesofascocarp；C:Paraphysis；D:Ascospore；E:Ascus圖24個羊肚菌樣品的ITS電泳圖譜Fig.2Theelectrophoretogramof4Morchellasp.amplifiedwithprimerITS4andITS52.3羊肚菌屬種的系統發育分析采用Neighbor-Joining法構建4個羊肚菌和GenBank中下載的12個羊肚菌屬種的基于ITS系列的系統發育樹狀圖（圖3）。待鑒定的羊肚菌4個樣品與Morchellaimportuna在同一個分枝上，其序列系相似性為100%，而與其它羊肚菌屬的8個種在不同分枝上，尖頂羊肚菌與待鑒定的羊肚菌序列相似性較小，分別在不同分枝上，按照Renske（2003）的觀點，當序列相似性＞99%時，為相同物種，因此，待鑒定的4個人工栽培羊肚菌應為梯紋羊肚菌Morchellaimportuna，而不是尖頂羊肚菌。3討論羊肚菌人工栽培已取得成功，在四川已大面積栽培出羊肚菌，一般產量達到1500kg/hm2，高的達到3000kg/hm2。人工栽培的羊肚菌大部分認為是尖頂羊肚菌，由于缺乏分子標記的證據，加上人工栽培的羊肚菌子囊果個體之間差異較大，難以根據系統特性鑒定出種名，將形態特征與ITSrDNA序列結合進行鑒定，才能準確定其分類地位。將人工栽培的羊肚菌ITSrDNA序列與GenBank中記載的已準確鑒定的羊肚菌物種的序列進行分析，發現待鑒定的人工栽培的羊肚菌4個標本的DNA序列與梯紋羊肚菌相似性達到100%，而與羊肚菌其它物種差異顯著，梯紋羊肚菌只在我國云南和河南有分布，在四川還未見有報道。由于GenBank中登載的羊肚菌屬種序列有66%是錯誤的[10],因此，利用GenBank中記載的羊肚菌屬種的序列進行比較鑒定時，應選擇已發表論文或專業科技人員鑒定后提交的序列。人工栽培的羊肚菌物種鑒定為梯紋羊肚菌，表明梯紋羊肚菌易進行人工栽培，因此，我們在開展羊肚菌人工栽培研究時，應對定向采集梯紋羊肚菌，對其進行菌種分離培養，通過系統篩選可獲得高產優質的品種，同時，對其生態習性進行調查，掌握其生態習性對指導人工栽培羊肚菌具有較大作用。圖3基于羊肚菌ITSrDNA序列的NJ系統發育樹Fig.3NJphylogenetictreeofITSrDNAregionsequencesofMorchellaspp.人工栽培成功的羊肚菌為主要梯紋羊肚菌，而其它羊肚菌物種是否也能進行人工栽培，還有待于開展人工栽培試驗。目前人工栽培羊肚菌是在耕地內，利用自然氣候栽培，產量和產品質量受環境的影響較大，穩定性較差，因此，還有待開展高產栽培技術研究和工廠化栽培技術研究，研究建立羊肚菌的高產、穩產技術體系，是開展規模化人工栽培羊肚菌的關鍵?！鞠嚓P文獻】[1]AlexopoulosCJ,BlaackwellM,MimsCW.IntroductoryMycology4thedn[C].JohnWiley&SonsInc,1996.[2]KirkPM,CannornPF,DavidJC,etal.Ainsworth&Bisby’sDictionaryofthefungi.9thEdn[C].CABInternational,Wallingford,2001.戴玉成，周麗偉，楊祝良，等.中國食用菌名錄[J].菌物學報，2010,29(1):1-21.趙琪，黃韻婷，徐中志，等.羊肚菌栽培研究現狀[J].云南農業大學學報，2010,24(6):904-907.程遠輝，趙琪，楊祝良，等.利用圓葉楊菌材栽培羊肚菌初報[J].中國農學通報，2009,25(21):170-172.[6]趙丹丹，李凌飛，趙永昌，等.尖頂羊肚菌人工栽培[J].食用菌學報，2012,17(1):32-35.沈洪，陳明杰，趙永昌，等.云南羊肚菌rDNA的ITS序列與親緣關系分析[J].食用菌學報,2007,14(2):15-18.戴璐，李峻志，李安利，等.基于ITS序列分析對秦嶺冷水溝羊肚菌的鑒定[J].中國食用菌,2010,29(6):45-46.[9]Xi-HuiDU,QiZhao,KerryO’Donnell,etal.Multigenemolecularphylogeneticsrevealstruemorls(Morchella)areespeciallyspe