實驗數據與結果第3章實驗數據與結果3.1多肽化合物的體外表征3.1.1多肽化合物的質譜結果Comp.1：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.63；Comp.2：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.83；Comp.3：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.94；Comp.4：MALDI-TOF:calcM+=2125.9152，obsvd(M+H)+=2127.75。結果表明，我們成功制備合成了所設計的化合物Comp.1、Comp.2、Comp.3，Comp.4。3.1.2多肽化合物的轉化率我們通過LC-MS測得在不同時間點，去磷酸化后的三種多肽化合物的轉化率。從圖2中可以看出多肽Comp.1在4h轉化90%左右；Comp.2在1h中后可快速轉化60%，之后轉化速率降低，在4h后也只能轉化74%左右；Comp.3相對其他兩組轉化得更加緩慢，4h只能轉化55%左右。我們猜想這應該是由于不同磷酸化位點，而引起的轉化率不同。圖3.1多肽化合物的轉化率3.1.3臨界聚集濃度(CAC)為判斷不同化合物的組裝能力，采用動態光散射(DLS)分別測定了多肽化合物Comp.1、2、3和4的臨界聚集濃度。如圖3所示，我們可以得出Comp.1的CAC值最低，在85.7uM左右；CAC值約為89.6μM的Comp.2次之，Comp.3的CAC值約為105.4μM，這可能是由于磷酸化位點的不同而導致臨界聚集濃度的差異。與之相比，不帶磷酸化的多肽Comp.4的CAC值則更加的高，約為130.7μM。由此可見，Comp.1具有最出色的組裝能力。圖3.2多肽化合物的CAC圖表3.1.4多肽化合物的體外酶響應性研究我們通過透射電子顯微鏡觀察加入堿性磷酸酶(ALP)前后，三種多肽化合物的微觀形貌變化，這有助于更好地發現和說明宏觀變化的內在因素。圖3.3顯示，Comp.1與Comp.2的PBS溶液中存在直徑6nm~7nm的較為粗短的納米原纖維結構，而Comp.3的PBS溶液中納米纖維分布較為疏松。此后，我們將ALP添加到Comp.1、2、3的PBS溶液中37℃孵育，電鏡結果顯示它們分別形成50nm~70nm左右的納米纖維，分布致密且有較多的交聯節點。圖3.3ALP催化前后的多肽化合物的微觀形貌3.1.5多肽化合物與EGFR受體的結合如圖3.4所示，多肽Comp.1在轉化之前的與EGFR生長因子的結合常數為51.44μM,而其他帶有不同磷酸化位點的多肽化合物分別為3.11μM、7.52μM，Comp.1約為它們的17倍、7倍，與EGF蛋白結合常數(459.89nM)相比差距較大。由圖3.5可得，當加入ALP之后，實現多肽上酪氨酸的去磷酸化，Comp.1組為738μM，明顯低于未加ALP的組別，也展現出了與EGF蛋白相似的結合常數。酶促自組裝策略可以提高－YHWYGYTPQNVI－與EGFR受體的結合選擇性，同時也說明只有在正確的位點才能提高EGFR結合的選擇性。圖3.4多肽化合物、EGF蛋白與EGFR受體的結合常數圖3.5去磷酸化的多肽與EGFR受體的結合常數3.2多肽化合物在細胞水平上對腫瘤細胞的檢驗3.2.1模式細胞的選擇本課題通過商用抗體對幾種不同細胞系的胞外堿性磷酸酶ALP與EGFR受體的豐度進行檢測，以此篩選并確定最終的模型細胞即最高表達量ALP與EGFR的腫瘤細胞。如圖3.6（a）所示，隨著時間變化，ALP與底物相應的吸收值增加；同時，在時間點上的斜率越大，說明ALP的相對含量也越大。SCC15、UMI、TSCCA和CAL-27腫瘤細胞的胞外ALP酶含量較高且這四種細胞系ALP含量差異較小，這幾種頭頸部腫瘤細胞的胞外ALP的含量均高于HUVEC人臍靜脈內皮細胞。在圖3.6（b）中，左側是平均熒光強度，右側是陽性細胞比例(即抗體標記的細胞占總細胞數量的比例)；可以看出TSCCA的EGFR豐度最大，其次是HN4。綜合兩者ALP與EGFR豐度結果來看，本課題選定TSCCA作為我們的模型細胞，以此與不同的多肽化合物培養從而選擇最佳的多肽序列。(a)(a)(b)Cells圖3.6(a)不同細胞外ALP與顯色底物作用的吸收值；(b)不同細胞中針對EGFR受體的平均熒光強度(左)與陽性細胞比例(右)3.2.2基于TSCCA細胞的最優多肽選擇本課題用不同多肽序列Comp.1、2、3、4與該腫瘤細胞進行培養，并檢測哪一種序列能在細胞周圍有效形成納米纖維，以此確定最優多肽序列。通過共聚焦顯微鏡的直觀觀察，與其他化合物相比，多肽Comp.1熒光強度最高，在TSCCA腫瘤細胞周圍聚集，由此推測，不同的磷酸化位點能影響多肽化合物對腫瘤細胞的選擇性，而其中Comp.1的多肽序列能更好地在腫瘤細胞實現酶促自組裝而形成納米纖維，因此確定Comp.1作為本課題的最優多肽。圖3.7不同多肽化合物培養TSCCA細胞的共聚焦成像3.2.3最優多肽對不同細胞的檢測將多肽化合物Comp.1與多種細胞進行培養后，通過流式細胞術驗證該多肽化合物對不同的腫瘤細胞或正常細胞的選擇性，如圖3.8所示，這些細胞所得的MFI很明顯高于空白對照，即說明該策略中對不同細胞的EGFR檢測的普適性；而其中TSCCA細胞的平均熒光強度最高，也驗證了Comp.1對TSCCA細胞的高選擇性。圖3.8多肽Comp.1培養的不同細胞的平均熒光強度與空白對照結論本課題根據人舌鱗癌細胞TSCCA的細胞膜外過表達堿性磷酸酶(ALP)以及細胞膜上過表達的受體EGFR的特點，將響應ALP的磷酸化酪氨酸(pY)與響應EGFR的多肽序列-YHWYGYTPQNVI-相結合，最終設計與合成能實現酶促自組裝的多肽化合物。這種多肽化合物Comp.1可響應細胞外的堿性磷酸酶而發生自組裝行為，形成直徑約為60nm~70nm的納米纖維，且與EGFR膜受體結合性良好。在細胞水平上，首先，我們根據EGFR以及胞外ALP的表達量，確定模型細胞TSCCA。由于多肽的封端NBD的熒光性，觀察到該化合物能在細胞周圍或細胞膜表面進行原位自組裝形成納米纖維，從而確定多肽Comp.1具有良好的胞外富集度，驗證了其自組裝行為以及在細胞周圍的分布情況。另一方面，再將多肽Comp.1與多種細胞進行培養后，通過流式細胞術驗證了該多肽化合物對不同的腫瘤細胞或正常細胞的選擇性。酶促自組裝策略構建了一種能夠靶向腫瘤細胞的納米材料，并能通過熒光分子實現腫瘤細胞的高選擇性檢測，可為個性化醫療提供相應的理論支持。本課題結合多肽合成、納米材料、細胞工程等學科領域，體現出交叉學科的特點，拓寬了基于多肽自組裝材料的應用范圍，為制備新型納米藥物遞送體系開發了新的策略與研究方向。盡管有許多開創性工作已證明了酶促自組裝策略在制備超分子納米材料中的重要性，但仍然面臨各種挑戰。為了實現酶促自組裝原位形成納米材料，大多數工作都是在腫瘤細胞上進行的，因此在后續實驗中，還可通過識別在其他疾病部位表達水平升高的酶來進行自組裝，開發出對這類疾病的診斷或治療方法。同時，大多數報道的例子都用一種酶來證明，而由兩種酶構建或控制的超分子納米材料可能對目標細胞和器官顯示出更高的選擇性，這也要求我們對酶催化多肽折疊和自組裝的機理的理解更深。另一方面，還存在著許多其他誘導多肽自組裝的方法，若將它們與酶促自組裝策略結合，可能會以更可控的方式形成納米材料。而迄今為止，大多數工作都是在體外進行的，因此，酶促自組裝策略的體內應用也待研究。參考文獻[1]李沙沙.七甲川菁類比率型熒光探針的構建及其在生物酶活性分析中的應用[D].青島科技大學.[2]袁禮彬.新型腫瘤血管生成抑制劑來那度胺衍生物的設計與合成[D].北京工業大學,2015.[3]王娟,鄒千里,閆學海.肽超分子自組裝:結構調控和功能化[J].化學學報,2017,75(10):10.[4]苗小明.具有氧化還原響應性的含硒小分子多肽自組裝體系[D].南開大學.2011.[5]張從柔.多肽基納米材料用于腫瘤的診斷和治療研