條件性基因敲除與敲入1整理ppt在科學研究中，為了明確某一組織或器官的功能，常將實驗動物體內所要研究的組織或器官切除，進而根據實驗動物的生理指標或功能的變化來推測切除局部的功能。生命科學開展到今天，人們對于生命現象的認識已經逐步深入到了分子水平，而上述的“局部切除—觀察整體—推測功能〞的研究思想仍然有效。具體地說，就是在分子水平破壞想要研究的基因，然后觀察生物體的生理指標、功能、整體形態、組織結構、發育過程的變化等，進而推測相應基因的功能。這種研究過程稱為基因敲除(geneknockout)。此外，為了研究某種疾病與某個基因之間的關系，常向生物體內人為引入某個基因，然后觀察實驗動物出現的各種變化，從而推測疾病與基因的關系，這種研究方法稱為基因敲人(geneknockin)。2整理ppt實現基因敲除的方法有多種，但根本上都是采用同源重組或隨機整合的方法，讓一段沒有生理功能的DNA片段在細胞內取代正常基因，從而破壞正常基因的功能。基因敲除主要是在胚胎干細胞(embryonicstemcells，ESC)水平進行操作。胚胎干細胞是早期胚胎細胞經體外培養建立的全能細胞系，在體外培養時保持了未分化狀態，可以傳代增殖，在發育上類似于早期胚胎細胞團的細胞，具有與早期胚胎細胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點，是研究哺乳動物個體發育、胚胎分化以及性狀遺傳機制的理想模型。首先在這種細胞內進行分子水平的基因操作，之后再使這種已經發生了基因改變的細胞發育成為一個完整的生物體。這樣就可以在整個生物體內實現預期的基因改變。

3整理ppt經典的基因敲除的具體實施方法可以簡述如下：選擇需要研究的目的基因的局部或全部DNA片段，通過分子生物學方法使其產生突變，然后與相應的載體進行重組，成為靶載體。別離試驗動物的胚胎干細胞，在體外將上述靶載體導入到胚胎干細胞內，使其與細胞內相似或相同的序列進行同源重組，替代細胞內原來的基因。通過一定的篩選方法篩選出發生同源重組的細胞，再將其注入囊胚腔內；把經過上述處理的囊胚重新植入到假孕小鼠的子宮內，使其發育成為一個完整的個體。含有相應突變基因的嵌合體雄性小鼠與正常雌性小鼠進行交配后，通過篩選可獲得攜帶該突變基因的純合子小鼠。4整理ppt通過上述方法所獲得的基因敲除小鼠模型，其身體的各種組織、器官以及小鼠生存的各個時期都攜帶有突變基因，相應基因的功能也發生了變化。這是一種非常經典的基因敲除方法，該方法對說明某些基因的功能做出了十分重要的奉獻。但是，對于某些特殊的基因，該方法往往顯得無能為力，這些基因在胚胎發育過程中或者在成熟生物體內具有至關重要的功能。當這些基因突變后，胚胎往往不能發育至正常分娩，或者即使能夠出生也會因為過于嚴重的生理缺陷而過早夭亡，無法開展后續研究，或者這些基因突變后影響到實驗動物的繁殖功能而不能產生后代，進而不能獲得攜帶突變基因的純合子動物模型。針對上述問題，近年來出現了一種特殊的基因敲除或敲入方法，被稱為條件性基因敲除或敲入(conditionalgeneknockoutorknockin)。這種方法是指在特定的組織細胞或者細胞發育的特定階段敲除某一特定基因的實驗技術。其優勢在于克服了經典基因敲除手段所遇到的上述問題，對于在特定的組織細胞和(或)特定的時間研究特定基因的功能，以及更好地建立人類疾病的動物模型都具有十分重要的意義。5整理ppt一、條件性基因敲除的策略

——Cre/loxP重組系統6整理ppt1．Cre/loxP系統的原理Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發現，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp〔EMBL數據庫登錄號X03453〕，編碼38kDa蛋白質。是一種位點特異性重組酶，能介導兩個loxP位點〔序列〕之間的特異性重組，使loxP位點間的基因序列被刪除或重組。7整理pptloxP〔locusofX-overP1〕序列：來源于P1噬菌體，是由兩個13bp反向重復序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了loxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合，13bp的反向重復序列是Cre酶的結合域。其序列如下：8整理pptCre重組酶介導兩個loxP位點間的重組是一個動態、可逆的過程，可以分成三種情況：

1、如果兩個loxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個loxP位點間的序列；

2、如果兩個loxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個loxP位點間的序列倒位；

3、如果兩個loxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。9整理ppt10整理ppt2．Cre/loxP系統優點Cre/loxP系統之所以在基因敲除中獲得了非常廣泛的應用，是由該系統的諸多優點決定的：①Cre重組酶與具有loxP位點的DNA片斷形成復合物后，可以提供足夠的能量引發之后的DNA重組過程，因此該系統不需要細胞或者生物體提供其他的輔助因子；②loxP位點是一段較短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重組酶是一種比較穩定的蛋白質，因此可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發揮作用；④Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動子的調控之下，從而使這種重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官，以及不同的發育階段或不同的生理條件下產生，進而發揮作用，這一點也是該系統在應用過程中最為重要的一點。11整理ppt

3．Cre/loxP系統的工作流程利用Cre/loxP系統實現體內某特定基因在特定條件下的敲除，需要兩只轉基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干細胞技術獲得，首先在體外構建一個在目的基因兩端分別含有一個loxP位點的基因序列，之后將體外構建好的這段基因序列轉入胚胎干細胞內，使其通過同源重組替代細胞基因組內原來的基因序列。經過這樣處理的胚胎干細胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內，使其重新發育成為一個完整的胚胎，最終成為一只轉基因小鼠。在這只轉基因小鼠中，loxP位點被引入到相應基因的內含子內，理論上不會對相應基因的功能產生影響，因此一般情況下，該小鼠的表型是正常的。12整理ppt第二只轉基因小鼠一般采用卵母細胞注射或者胚胎干細胞技術獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于某特定基因啟動子的調控之下，可以使其在某特定的條件下表達。最后，讓這兩只小鼠進行交配，產生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的細胞中缺失某一特定的基因。很明顯，在何種組織細胞或器官中敲除某一特定的基因取決于所選擇的啟動子。只要選擇適宜的啟動子調控Cre重組酶的表達，使其在生物體特定的部位、特定的條件下產生，就可以實現相應條件下某一特定基因的敲除。13整理ppt14整理ppt迄今為止，研究者們已經成功地利用多個不同的啟動子實現了在不同條件下的基因敲除，這些啟動子可以是細胞類型特異的，如lck啟動子(胸腺細胞)、alphaA晶狀體球蛋白啟動子(眼晶狀體)、鈣調素依賴性激酶Ⅱ啟動子(海馬和大腦新皮質)、乳清酸性蛋白啟動子(乳腺)、aP2啟動子(脂肪組織)、AQP2啟動子(腎臟集合管)和肌漿蛋白啟動子(骨骼肌)等。啟動子也可以受某些外源性化學物質的調控，外源性調控的基因敲除可以防止在胚胎發育早期由于基因功能的異常所產生的副作用，如干擾素反響Mxl啟動子、他莫西酚依賴的雌激素突變體啟動子和四環素調節系統等。15整理pptloxP轉基因動物的構建

loxP轉基因動物是在基因組中待修飾基因區域的兩側各插入了1個loxP位點的轉基因動物。該轉基因動物的構建首先需要一種特殊的載體，這種載體主要由3個局部組成：①分別存在于打靶載體5’和3’臂端，是與靶基因一定區域相同的同源序列，其作用是介導打靶載體與靶基因之間的同源重組。②位于5’和3’臂端之間有待敲除的靶基因區段序列或有待敲入的外源序列和選擇標志基因。選擇標志基因一般為neo—tk基因，含有兩個選擇標志：一個為G418抗性基因(neo)，為細胞提供針對G418的抗性，為正篩選標記；另一個為胸腺嘧啶激酶基因(tk)，可以把培養基中的更昔洛韋(ganciclovir)磷酸化為對細胞有毒的化合物，為細胞提供負篩選標記。③3個loxP位點，分別位于待敲除靶基因同源序列的兩側和選擇標志基因的兩側。一般采用線性化的打靶載體來轉染胚胎干細胞，常選用位于同源序列邊緣或之外的限制性內切酶作用位點作為打靶載體線性化的切點。取代型打靶載體整合進基因組的結果是靶載體中的序列置換掉基因組中的同源序列。16整理ppt

loxP轉基因動物的構建一般采用胚胎干細胞基因轉移法。在這個過程中，首先要構建具有3個loxP位點的打靶載體。該載體中loxP位點的分布情況如下：選擇標志基因(如neo—tk)的兩側各一個，從而能夠使選擇標志基因在Cre的介導下消失，以防止它們在基因組中的存在可能給轉基因動物造成危害；預期要進行敲除的基因兩側各一個，在Cre的作用下可以介導目標基因的敲除。在載體構建成功后，用電穿孔等方法將其導入到胚胎干細胞中，使其以同源重組的方式整合進干細胞的基因組，之后經G418篩選，用PCR和DNA印跡(Southernblotting)等方法來確定靶基因是否發生了同源重組。最后，為了去除篩選標志基因，要向上述的胚胎干細胞中導人Cre的瞬時表達質粒。這時，在Cre的作用下，具有3個loxP位點的靶基因區域會產生3種后果：17整理ppt①發生Ⅰ型缺失，3個loxP之間的所有基因(靶基因和選擇標志基因)全部被切除，只保存1個loxP位點。②發生Ⅱ型缺失，只有選擇標志基因被切除，兩個loxP位點及其之間的靶基因被保存。發生了Ⅰ或Ⅱ型缺失的胚胎干細胞在更昔洛韋選擇培養下均能生長，再用PCR和DNA印跡等方法來對缺失突變的結果進行鑒定。③Ⅲ型缺失，靶基因被切除而選擇標志基因被保存，發生此型突變的細胞在更昔洛韋存在時無法生存。經過更昔洛韋培養基篩選后，可以篩選出發生Ⅱ型缺失的胚胎干細胞。再用囊胚注射法將經過這種遺傳改造的胚胎干細胞注入囊胚，最后移植入代孕母鼠的子宮內，獲得具有Ⅱ型缺失突變的轉基因動物，在其基因組中特定的基因位置具有兩個loxP位點。18整理ppt19整理ppt受精卵雄性原核顯微注射法構建Cre轉基因動物

Cre轉基因動物即時空特異性表達重組酶Cre的轉基因動物。構建此動物的目的在于為loxP轉基因動物提供重組酶Cre。由于在該轉基因動物中Cre的表達被置于特異性啟動子的調控之下，因此它會以組織細胞特異性和發育階段特異性的方式向loxP轉基因動物提供Cre重組酶，以便在特定的發育階段、特定的組織細胞中使兩個loxP之間的區域缺失。當然，實現此目標的最前方法就是讓這兩種轉基因動物進行雜交。構建Cre轉基因動物與構建普通轉基因動物的方法相似，最為常用的基因轉移方法仍為受精卵雄性原核顯微注射法和胚胎干細胞的囊胚注射法。20整理ppt先將Cre時空特異表達載體線性化后注入雄性原核，使其以隨機插入的方式整合進基因組，然后將該受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的輸卵管或子宮內。受精卵雄性原核顯微注射法的具體步驟簡述如下：1．準備假孕母鼠

將可育雌鼠與輸精管結扎后絕育的雄鼠交配，刺激雌鼠發生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠作為受精卵轉基因后的養母。2．受精卵的準備

可育雌鼠注射孕馬血清與絨毛膜促性腺激素(HCG)，以促使其超排卵。處理后與可育雄鼠交配，次日從輸卵管內收集受精卵備用。3．基因導入

用顯微注射裝置將目的基因溶液導入受精卵雄性原核內。4．胚胎移植將已轉入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的輸卵管內，使胚胎在養母體內發育成熟。5．對幼鼠的鑒定(1)幼鼠發生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交，鑒定外源基因是否整合。(2)建立鼠系，將帶有外源基因的小鼠與未經轉基因的小鼠交配、傳代后，后代有50％概率帶有整合的基因供實驗用。也可將適宜的組織進行細胞培養，建立細胞系。(3)自小鼠內臟提取RNA，與目的基因探針做分子雜交，以鑒定外源基因的表達和表達的組織特異性。表達產物可以測定活性的，也可直接自血液或組織測定活性蛋白質，常用的方法如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或放射免疫測定(RIA)等。亦可取胚胎進行分析。21整理ppt受精卵雄性原核顯微注射法構建Cre轉基因動物22整理ppt胚胎干細胞的囊胚注射法構建Cre轉基因動物

先將Cre時空特異表達載體線性化，之后用電穿孔等方法將其導入胚胎干細胞中，并以同源重組的方式整合進胚胎干細胞的基因組。這種經過遺傳改造的胚胎干細胞再被注入囊胚，最后將胚胎植入假孕母鼠的子宮，使其發育成為一個個體。囊胚注射法的具體步驟如下：(1)選擇適宜的載體，將Cre重組酶的編碼基因與其重組，構建重組質粒。(2)重組質粒線性化后，用電穿孔、脂質體等方法將其轉入體外培養的小鼠胚胎干細胞中。(3)體外篩選穩定整合外源基因的胚胎干細胞。(4)篩選出的胚胎干細胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內，使其重新發育為一個完整的胚胎。(5)產出的嵌合體小鼠通過雜交，最終獲得穩定整合Cre重組酶的純合體轉基因小鼠。23整理ppt24整理ppt采用雄性原核顯微注射法時，Cre表達基因是隨機的整合到基因組中去的，因此其表達的時空特異性和表達水平除了受啟動子的影響外，還會受到整合位點的影響，因此需要同時生產多個轉基因鼠家系，以便從中選出符合要求的轉基因鼠。采用這種方法時選擇適宜的啟動子就顯得尤為重要。該方法的優點是操作過程比較省時省力。另外一種構建Cre轉基因小鼠的方法是采用同源重組，使Cre基因置于內源性啟動子的控制之下。這個策略可以實現Cre基因表達的最正確化，因為這時所有的基因表達調控元件均處于天然位置，可以防止常規轉基因小鼠通常出現的異位表達問題。此外，采用這種方法只要獲得靶基因的同源序列就可以進行，沒有必要再去詳細研究其啟動子。但是該方法的缺點是操作過程費時費力。因此，當有適宜的啟動子可供選擇時，多數研究者寧愿使用雄性原核顯微注射法生產Cre轉基因小鼠。25整理ppt由此我們知道，Cre轉基因動物的關鍵在于控制Cre基因表達啟動子的選擇，因為啟動子活性的時空特異性決定了Cre基因表達的時空特異性，進而決定Cre介導的loxP轉基因動物基因組中相應靶基因發生預期突變的時空特異性。可以理解，借助于Cre/loxP系統的作用，利用一種Cre轉基因動物就可分別對多種基因在個體發育或疾病發生中的作用機制進行研究。理論上，Cre/loxP系統介導的條件性基因敲除具有對任何發育階段的任何組織細胞中的任何基因進行功能研究的潛力。26整理ppt條件性基因敲除的實現

在構建好上述兩個轉基因小鼠后，條件性基因敲除就比較容易實現了。所需要進行的最后一步操作就是讓這兩種轉基因小鼠進行交配。所產生的子代小鼠同時具有Cre的外源表達基因和經過loxP修飾的目的基因，根據Cre表達的時空特異性就可以實現目的基因在特定組織中、特定發育階段發生預期的改變。27整理ppt28整理ppt基于Cre/loxP系統建立的四環素誘導條件性基因敲除系統該系統包含兩個互補系統，分別為tTA依賴和rtTA依賴的基因敲除系統，現在又被稱為Tet—Off(tTA依賴)系統和Tet—On(rtTA依賴)系統。在這兩個系統中，四環素控制轉錄因子tTA或rtTA與啟動子Ptet的結合，從而調節下游基因的表達。所不同的是tTA與啟動子Ptet的結合是不需要四環素的，四環素阻礙兩者之間的相互作用；而rtTA與啟動子Ptet的相互結合只有在四環素或者其衍生物多西環素(強力霉素)存在的情況下才會發生，沒有四環素或者多西環素時兩者不發生相互作用。因此這兩個系統以相反的方式對四環素進行反響，成為兩個互補系統。29整理ppt該系統含有3個根本的要素：tTA或rtTA，Ptet，四環素或多西環素。其中tTA或rtTA作為一種轉錄因子是一個融合蛋白，具有兩局部：一局部為來源于原核生物體內的四環素阻礙蛋白(Tetrepressor，TetR)；另一局部為來源于真核生物體內，是真核細胞內轉錄因子的轉錄激活結構域，應用最為廣泛的是單純皰疹病毒編碼的VPl6的酸性結構域。這兩局部構成的融合蛋白(tTA或rtTA)可以受四環素或者其衍生物的調節而發生構象變化，從而改變與相應的DNA序列(四環素抗性元件，Tetresistanceoperon，TetO)的結合能力。tTA或rtTA的另一個功能就是轉錄激活功能，當其在真核細胞內與相應的DNA反響元件結合后可以啟動下游基因的轉錄。rtTA與tTA相比有幾個氨基酸位置的突變，突變的結果是兩者對四環素反響后產生的效應完全相反。rtTA只有在四環素存在的情況下才能與反響元件TetO相結合，而tTA只有在四環素不存在的情況下才能與TetO結合。在具體的應用中，tTA或rtTA被置于特定啟動子的調控之下，以實現其在特定的組織器官中進行表達。30整理pptPtet是一個受tTA或rtTA調控的啟動子，含有一個RNA聚合酶Ⅱ啟動子的最小功能單位和假設干個TetO序列，該啟動子只有與tTA或rtTA結合時才能激活下游基因的表達。因此，在應用過程中Ptet被用來調控Cre重組酶的產生。四環素或多西環素作為Tet—On和Tet—Off系統的效應劑，與tTA或rtTA相互作用從而調節它們與Ptet的親和力。多西環素是四環素的衍生物，由于其具有毒性小、所用劑量小等優點，在實際應用中更為廣泛。該系統發揮作用的機制如下圖。31整理ppt32整理ppt

采用該系統進行條件性基因敲除時，要將受特異性啟動子調控的tTA的表達載體轉入小鼠體內，同時還要將受Ptet啟動子調控的Cre重組酶的表達載體也轉入小鼠體內。這樣一個轉基因小鼠與loxP的轉基因小鼠進行交配，產生的子代小鼠中會在特定組織和器官中表達tTA，tTA再與Ptet結合后激活下游的Cre重組酶的表達，實現特定基因在特定組織器官中的敲除。如果在子代小鼠出生時就給予四環素，并且一直維持下去，特定基因的敲除就不會發生，只有在停止四環素的應用后才會發生該基因在特定部位的喪失。采用rtTA系統與上述情況正好相反，在不用四環素時基因敲除不發生，只有給予四環素時才會導致特定基因在特定部位的敲除。因此，該系統可以對靶位點的剔除或修飾進行時間和空間二維調控。33整理ppt基于Cre/loxP系統建立的他莫昔芬誘導條件性基因敲除系統該系統將雌激素受體(estrogenreceptor，ER)的配體結合區(ligand—bindingdomain，LBD)和Cre重組酶進行融合，產生一種嵌合重組酶，該嵌合重組酶的表達被置于特異啟動子的調節之下，從而使其在特定組織和器官或者特定發育階段產生。但是只有該嵌合重組酶并不能發揮Cre重組酶的活性，因為雌激素受體結合區的存在使其不能進入核內與loxP位點相結合。只有參加雌激素后才能使其進入核內發揮作用。為了消除內源性雌激素的影響，研究者將雌激素配體結合區進行了關鍵氨基酸的突變，從而使其不能與體內的生理性雌激素結合，而只能與外源性的雌激素類似物他莫昔芬結合，這樣就消除了內源性雌激素所造成的非特異性基因敲除。該系統與四環素誘導系統相似，也可以對靶基因的敲除進行時間和空間二維調控。利用該系統，Schwenk等在1998年成功建立了B淋巴細胞特異啟動子調控的E／1／SV40—CreERT轉基因小鼠，并成功實現了他莫昔芬的誘導，結果顯示在B淋巴細胞中Cre介導的重組效率到達了80％。34整理ppt二、條件性基因敲除的策略

——Flp/FRT系統

該系統與Cre/loxP系統相同，也是由一個重組酶和一段特殊的DNA序列組成。從進化的角度上考慮，Flp/