ICS70.080CCSB44 43湖 南 省 地 方 標 準DB43/T959.2—2023代替DB43/T959.2—2014MedicalgradeDPFdonorpigforxenotransplantationPart2:mircrobiologicalparasitologicalstandardsandsurveillance202311092024MedicalgradeDPFdonorpigforxenotransplantationPart2:mircrobiologicalparasitologicalstandardsandsurveillance2023110920240209湖南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言Ⅲ引言Ⅴ112規(guī)范性引用文件13語定義············14生學級·········35測求36測序37測法38測則59果定610定論611本存6附錄A（范）牛枝菌PCR檢方法7B（）PCR8C（）DNAPCR9D（）ELISA················10附錄E（規(guī)范性）豬蘭氏類圓線蟲病鏡檢法診斷11附錄F（規(guī)范性）··12附錄G（規(guī)范性）ELISA·························13附錄H（規(guī)范性）PCR··14附錄I（規(guī)范性）FQ-PCR·15附錄J（規(guī)范性）17附錄K（規(guī)范性）（SADS‐CoV）RT‐PCR19附錄L（規(guī)范性）（PRCV）PCR20附錄M（規(guī)范性）豬凝性脊炎毒測21附錄N（規(guī)范性）C（PERV-C）PCR24附錄O（規(guī)范性）3TaqManPCR25附錄P（規(guī)范性））26前 言GB/T1.1—20201DB43/T959（DesignatedPathogenFreeDPF）DB43/T959——第1部分：遺傳質(zhì)量控制；——第2部分：微生物、寄生蟲學等級與監(jiān)測；——第3部分：配合飼料；——第4部分：病理學診斷規(guī)范；——第5部分：環(huán)境與設施。DB43/T959.2—2014（DesignatedPathogenFree,DPF）醫(yī)用供體豬第DB43/T959.2—201417，20147）；d）更改了“檢測頻率”（見8.1，2014版的8.1）；e）更改了“表2抽樣數(shù)量”（見8.2.2，2014版的8.2.2）。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省科學技術(shù)廳提出并歸口。17，20147）；d）更改了“檢測頻率”（見8.1，2014版的8.1）；e）更改了“表2抽樣數(shù)量”（見8.2.2，2014版的8.2.2）。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省科學技術(shù)廳提出并歸口。本文件起草單位：中南大學湘雅三醫(yī)院，湖南賽諾生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王維、羅敏華、李桑、蔡亮、胡鵬志、馬小倩、徐暢、王佳、石興勇。本文件及其所替代文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2014年首次發(fā)布為DB43/T959.2—2014；——本次為第一次修訂。引 言（DesignatedPathogenFree,DPF）959（DesignatedPathogenFree,DPF）DB43/T959——第1部分：遺傳質(zhì)量控制。目的在于維持異種移植用無指定病原體醫(yī)用供體豬遺傳質(zhì)量穩(wěn)定性。——第2部分：微生物、寄生蟲學等級與監(jiān)測。目的在于保證異種移植用無指定病原體醫(yī)用供體豬生物安全性。——第3部分：配合飼料。目的在于保障異種移植用無指定病原體醫(yī)用供體豬飼料的安全和營養(yǎng)。——第4部分：病理學診斷規(guī)范。目的在于標準化異種移植用無指定病原體醫(yī)用供體豬病理學檢測內(nèi)容和方法。——第5部分：環(huán)境與設施。目的在于標準化異種移植用無指定病原體醫(yī)用供體豬環(huán)境條件控制和設施建設。2014DB43/T959.22018DB43/T959.2DB43/TDB43/T959.2異種移植用無指定病原體（DesignatedPathogenFree,DPF）醫(yī)用供體豬第2部分：微生物、寄生蟲學等級與監(jiān)測本文件規(guī)定了異種移植用無指定病原體（DesignedPathogenFree,DPF）醫(yī)用供體豬微生物學等級分類、檢測要求、檢測程序、檢測方法、檢測規(guī)則、結(jié)果判定、判定結(jié)論、樣本保存等。本文件適用于異種移植用DPF醫(yī)用供體豬微生物學等級監(jiān)測。（GB/T14926.4實驗動物皮膚病原真菌檢測方法GB/T14926.8實驗動物支原體檢測方法GB/T14926.27實驗動物小鼠腺病毒檢驗方法GB/T14926.30實驗動物兔輪狀病毒檢測方法GB/T14926.46實驗動物鉤端螺旋體檢測方法GB/T14926.47實驗動物志賀菌檢測方法GB/T14926.48實驗動物結(jié)合分枝桿菌檢測方法GB/T14926.56實驗動物狂犬病病毒檢測方法GB/T16551豬瘟診斷技術(shù)GB/T14926.4實驗動物皮膚病原真菌檢測方法GB/T14926.8實驗動物支原體檢測方法GB/T14926.27實驗動物小鼠腺病毒檢驗方法GB/T14926.30實驗動物兔輪狀病毒檢測方法GB/T14926.46實驗動物鉤端螺旋體檢測方法GB/T14926.47實驗動物志賀菌檢測方法GB/T14926.48實驗動物結(jié)合分枝桿菌檢測方法GB/T14926.56實驗動物狂犬病病毒檢測方法GB/T16551豬瘟診斷技術(shù)GB17013包蟲病診斷標準及處理原則GB/T18090豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法GB/T18448.1實驗動物體外寄生蟲檢測方法GB/T18448.2實驗動物弓形蟲檢測方法GB/T18448.6實驗動物蠕蟲檢測方法GB/T19915.1豬鏈球菌2型平板和試管凝集試驗操作規(guī)程GB/T18648非洲豬瘟診斷技術(shù)GB/T18638流行性乙型腦炎診斷技術(shù)GB/T18641偽狂犬病診斷技術(shù)GB/T18646動物布魯氏菌病診斷技術(shù)GB/T18647動物球蟲病診斷技術(shù)GB/T18935口蹄疫診斷技術(shù)GB/T19200豬水泡病診斷技術(shù)SN/T1379.1豬瘟單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗SN/T1396弓形蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T1379.1豬瘟單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗SN/T1396弓形蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T1446.1豬傳染性胃腸炎阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。異種移植用DPF醫(yī)用供體豬medicalgradeDPFdonorpigforxenotransplantation，1250kgHealthOrganization，WHO）GB/T19915.2豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程GB/T19915.3豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術(shù)GB/T19915.7豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法GB/T21674豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應試驗方法GB/T22333日本乙型腦炎病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試驗方法GB/T22915口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測方法GB/T22917豬水泡病病毒熒光RT-PCR檢測方法GB/T27517鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復合RT-PCR方法GB/T27536豬流感病毒分離與鑒定方法GB/T21674豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應試驗方法GB/T34757豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法GB/T35912豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光RT-PCR檢測方法GB/T36871RT-PCRNY/T537豬傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范NY/T545豬痢疾診斷技術(shù)NY/T546豬傳染性萎縮性鼻炎診斷技術(shù)NY/T548豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)NY/T550動物和動物產(chǎn)品沙門氏菌檢測方法NY/T564豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)NY/T679豬繁殖和呼吸綜合癥免疫酶試驗方法SN/T0420出口豬肉旋毛蟲檢驗方法磁力攪拌集樣消化法SN/T1699豬流行性腹瀉檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T1919豬細小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T2708豬圓環(huán)病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T3499新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T4235豬戊型肝炎檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T5124Delta異種移植用DPF醫(yī)用供體豬微生物學等級為醫(yī)用供體無指定病原體級。外觀檢查無異常。異種移植用DPF醫(yī)用供體豬病原微生物檢測項目見表1。檢測程序見圖1。圖1異種移植用DPF醫(yī)用供體豬檢測程序圖1異種移植用DPF醫(yī)用供體豬檢測程序結(jié)合臨床癥狀和實驗室檢查結(jié)果，需要進一步確證時，可取特定樣本進行檢測。7檢測方法。表1異種移植用DPF醫(yī)用供體豬病原微生物檢測項目及檢測方法類型序號檢測項目檢測方法細菌類Bacterium1布魯氏菌BrucellasppGB/T186462鉤端螺旋體LeptospirasppGB/T14926.463豬痢疾蛇樣螺旋體SerpulinahyodysenteriaeNY/T5454牛型分枝桿菌Mycobacteriumbovis附錄A5結(jié)核分枝桿菌MycobacteriumtuberculosisGB/T14926.486細胞內(nèi)鳥型結(jié)核分枝桿菌復合物Mycobacteriumavium-intracelluarecomplex附錄B7豬肺炎支原體MycoplasmahyopneumoniaeGB/T14926.88沙門氏菌SalmonellatyphiGB/T14926.1；NY/T5509志賀氏菌ShigellaGB/T14926.4710支氣管敗血波氏桿菌BordetellabronchisepticaNY/T54611多殺巴氏桿菌PasteurellamultocidaNY/T546；NY/T56412豬胸膜肺炎放線桿菌ActinobacilluspleuropneumoniaeNY/T53713豬鏈球菌2型Streptococcussuistype2GB/T19915.1-3；GB/T19915.7真菌類Fungi14皮膚病原真菌PathogenicdermalfungiGB/T14926.415新型隱球菌Cryptococcusneoformans附錄C16莢膜組織胞漿菌Histoplasmacapsulatum附錄D寄生蟲類Parasites17體外寄生蟲EctozoaGB/T18448.118豬蛔蟲AscarissuumGB/T18448.619棘球絳蟲Echinococcussp.GB1701320等孢球蟲屬IsosporaspGB/T1864721豬蘭氏類圓線蟲Strongyloidesransomi附錄E22弓形蟲ToxoplasmagondiiGB/T18448.2；SN/T139623旋毛蟲TrichinellaspiralisSN/T042024新孢子蟲NeosporaSN/T349925布氏姜片吸蟲Fasciolopsisbuski附錄F病毒類Viruses26豬腺病毒Adenovirus(porcine)GB/T14926.2727豬腦心肌炎病毒Encephalomyocarditisvirus附錄G28豬流感病毒porcineInfluenzavirusGB/T2753629人流感病毒HumanInfluenzaviruses附錄H30豬巨細胞病毒Porcinecytomegalovirus附錄I31皰疹病毒Porcinegama-herpesvirus附錄J32豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性毒株P(guān)orcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGB/T27517表1異種移植用DPF醫(yī)用供體豬病原微生物檢測項目及檢測方法（續(xù)）類型序號檢測項目檢測方法病毒類Viruses33豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典毒株P(guān)orcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGB/T3591234豬細小病毒ProcineparvovirusSN/T191935輪狀病毒RotavirusGB/T14926.3036偽狂犬病病毒PseudorablesvirusGB/T1864137狂犬病病毒RabiesvirusGB/T14926.5638口蹄疫病毒FootandmouthdiseasevirusGB/T18935；GB/T2291539豬瘟病毒ClassicalswinefevervirusGB/T16551；SN/T1379.140日本乙型腦炎病毒JapanesesencephalitisvirusGB/T18638；GB/T2233341豬圓環(huán)病毒1型Porcinecircovirustype1GB/T21674；SN/T270842豬圓環(huán)病毒2型Porcinecircovirustype2GB/T21674；SN/T270843豬傳染性胃腸炎病毒PorcinetransmissiblegastroenteritisvirusGB/T36871；NY/T548；SN/T1446.144豬流行性腹瀉病毒PorcineepidemicdiarrheavirusGB/T36871；GB/T34757；SN/T169945豬德爾塔冠狀病毒PorcinedeltacoronavirusSN/T512446豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒Swineacutediarrheasyndromecoronavirus附錄K47豬呼吸道冠狀病毒PorcineRespiratoryCoronavirus附錄L48豬血凝性腦脊髓炎病毒Porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus附錄M49豬水泡病病毒SwinevesiculardiseasevirusGB/T19200；GB/T2291750豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒CPorcineendogenousretrovirusC(PERV-C)附錄N51豬淋巴性皰疹病毒Porcinelymphotropicherpesvirus(PLHV)附錄O52戊型肝炎病毒HepatitisEvirus(HEV)SN/T4235-201553新型冠狀病毒SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2（SARS-CoV-2）附錄P54非洲豬瘟病毒DiagnostictechniquesforAfricanswinefeverGB/T186488檢測規(guī)則8檢測規(guī)則每3個月至少檢測一次。抽樣3DPF根據(jù)異種移植用DPF醫(yī)用供體豬群體大小，抽樣數(shù)量見表2。表2抽樣數(shù)量群體大小抽樣數(shù)量＜50頭不少于3頭50-100頭不少于5頭100-500頭不少于10頭＞500頭不少于25頭注：臨床用豬需要進行100％檢測。采樣方法按照NY/T5418.3樣本標識要求9結(jié)果判定9結(jié)果判定9.1合格判定PCR9010判定結(jié)論DPFDPF11樣本保存間為1年。附錄A（規(guī)范性）牛分枝桿菌PCR檢測方法原理以牛分枝桿菌16SrRNA基因和IS6110基因為靶序列，建立雙重PCR方法。健康樣本1.5mLEP400μLK（lmg/mL）；558hEP8000rpm，5min1.5mLEP101.5mLEP120℃10min，703730μLTERNA，37℃，40min-20MycobacteriumbovisAF2122/97[gi:31742509]16SrRNAIS6110引物序列如下：16SrRNAP1:5’-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3’16SrRNAP2:5’-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3’擴增片段大小約為584bp。IS6110P1:5’-GGCTTGCCGGGTTTGA-3’IS6110P2:5’-TTTGTCACCGACGCCTACGCT-3’擴增片段大小約為309bp。PCR0mR2μ（1.75-1.μ10×PCRbuffer14μL，Taq0.5μL（2.5U）25μL。PCR7min，4℃保存。PCR0.8％的瓊脂糖，電壓120V，電泳12-15min，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測。結(jié)果判定按照設定的雙重PCR309bpIS6110584bp16SrRNAPCR附錄B（規(guī)范性）細胞內(nèi)鳥型分枝桿菌PCR檢測方法豬皮膚組織無菌條件下取上述組織1g左右，置入1.5mL潔凈EP管。上清液，2倍連續(xù)稀釋后裝于微量離心管中。B.3.2上清液，2倍連續(xù)稀釋后裝于微量離心管中。B.3.2PCR擴增插入序列IS1245：引物1為5’-GCCGCCGAAACGATCTAC-3’引物2為5’-AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-3’50μLPCR10×PCR5μL，25mmol/LMgCl25μL，dNTPs200μmol/L1μmol/LDNA10μL，TaqDNA1U945min94℃30s，65℃30s，72℃45s，擴增產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，花青素染色，用紫外檢測儀觀察結(jié)果并攝影。B.4結(jié)果判定。出現(xiàn)427bp擴增帶為陽性，未見427bp擴增帶為陰性。附錄C（規(guī)范性）新型隱球菌DNA實時熒光定量PCR檢測ITSPCR豬肺部分泌物PBS根據(jù)新型隱球菌的基因序列設計引物為：根據(jù)新型隱球菌的基因序列設計引物為：FP:5’-TTACCTGTTGGACTTGGATTTGG-3’RP:5’-CATAGGCCCAGCGAAACTTATT-3’DNASDSK，501h1520ul5ul50uL。以50μLPCR反應體系進行反應：10×PCRBuffer（含15mmol/LMgCl2）5μL，dNTPmixtureDNADNAddH2O50μL：94℃5min，94℃30s58℃1min40C.4結(jié)果判定5μLPCR1.510％GoldView）5V/cm60-75min124bp附錄D（規(guī)范性）抗莢膜組織胞漿菌抗體ELISA檢測方法用中國藥品生物制品檢定所研制的莢膜組織胞漿菌蛋白提取物（purifiedproteinfromHistoplasma豬血清無菌條件下用一次性注射器取耳靜脈血3mL-5mL，置于試管中，分離血清，待檢。1μg/，50μL/孔，37℃2h。孔，洗滌3次，每次3min。（5PBST），100μL/孔，3730min。1:1000），100μ/孔，洗滌3次，每次3min。（5PBST），100μL/孔，3730min。1:1000），100μ/，3730min。3）。1:10000（）100μL/，3745min。3TMB100μL/10-15min。50μL2mol/LH2SO4P/N：P/NODODD.4結(jié)果判定當被檢樣品的A0.135A0.059-0.135A0.059附錄E（規(guī)范性）豬蘭氏類圓線蟲病鏡檢法診斷豬糞便從豬舍地面及豬直腸分別采集豬的糞樣。E.3.2尼龍篩淘洗法檢查25g260積物制壓片，在10倍和40倍顯微鏡下檢查。E.3.2尼龍篩淘洗法檢查25g260積物制壓片，在10倍和40倍顯微鏡下檢查。（42-53）μm×（24-32）μm附錄F（規(guī)范性）布氏姜片吸蟲鏡檢法診斷豬新鮮糞便從豬舍地面及豬直腸分別采集豬的糞樣。F.3.2沉淀法5-10g20mLF.4結(jié)果判定F.3.2沉淀法5-10g20mLF.4結(jié)果判定130-145μm×85-97μm附錄G（規(guī)范性）豬腦心肌炎病毒間接ELISA檢測2C2CELISA豬血清無菌條件下用一次性注射器取耳靜脈血3mL-5mL，置于試管中，分離血清，待檢。2C（0.05mol/LpH9.6100μL/孔包371h4孔，洗滌3次，每次3min。（5PBST），100μL/孔，371h。），100μL/孔，37孔，洗滌3次，每次3min。（5PBST），100μL/孔，371h。），100μL/孔，3745min。3）。（）100μL/，3745min。3TMB100μL/10-15min。50μL2mol/LH2SO4OD450nmP/NP/NOD/G.4結(jié)果判定當被檢樣品的OD值＞0.27時，判定為陽性；當樣品的OD值＜0.27時，判定為陰性。附錄H（規(guī)范性）人流感病毒多重PCR檢測HAMRT-PCR鼻咽拭子12h，24hPCRH3R-5’-ctcaaatgcaaatgttgcacc-3’BF-5’-gggacatgaacaacaaagatgc-3’BR-5’-tgtcagctattatggagctg-3’H1、H3和乙型擴增產(chǎn)物分別431bp、210bp和390bp。H3R-5’-ctcaaatgcaaatgttgcacc-3’BF-5’-gggacatgaacaacaaagatgc-3’BR-5’-tgtcagctattatggagctg-3’H1、H3和乙型擴增產(chǎn)物分別431bp、210bp和390bp。RNA提取病毒RNA作為RT-PCR模板，用于反轉(zhuǎn)錄試驗或置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ迷噭┖羞M行病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄。PCR10×Buffer2.5μLdNTP2μL、Taq（5U/μL）0.4μLH（10mM）1.25μLcDNA4μL25μL3min，94℃30s、51℃1min68℃1min3568℃10min。PCR取PCR產(chǎn)物5μL，加入上樣孔后進行1％瓊脂糖凝膠電泳。H.4結(jié)果判定出現(xiàn)431bp、210bp或390bp條帶，判定為陽性。附錄I（規(guī)范性）豬巨細胞病毒FQ-PCR檢測原理TaqManPCRTaq3'→5病變組織無菌條件下取上述組織1g左右，置入1.5mL潔凈EP管。總RNA提取1.5L1Lrizolmin01000rm1.5mL200ul3-5min分層，12000rpm15min，1.5mL4DNA0.5mL（10min，RNA1mL75（）8000rpm5min（5s）2min15μLDEPC55-6010-15minOD260/280700.2mL1μLRNA，1μLoligo（dt），10μLDEPC5s，705min2min4μL5×Buffer，2μL0.1MDTT，2μL10MmdNTPs2min1μL4250min，7010min70TapMan設計一對特異引物P1/P2TapManP1:5’-TGGCACTGATACTTGACAAGC-3’P2:5’-CTCCCGTGAAGCCGTAAA-3’TapMan探針:FAM-5’-CAGCTTGCCCTCAAGGTGACGTG-3’-TAMRA。用含pGEMT/PCMV重組質(zhì)粒的溶液作標準品，10倍稀釋成1.0×1010-1.0×100拷貝/μL，共11FQ-PCRXCtYPCMVFQ-PCR5μmol/L2.5μmol/L60FQ-PCR25μL10×ExTaqBuffer2.5μL（Mg2+濃度2.0mmol/L），dNTPs2μLExTaq0.25μL0.5ul（10μmol/L），0.25μL（10μmol/L）1μL，ddH2O18.00μLPCRFAM/TAMRAPCR以電泳陰性對照為標準，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否有陽性產(chǎn)物。附錄J（）原理DNA（Taq）SD-Buffer（Mg2+、Tris-HCl（dNTPs）EB染色，紫外血清或病毒液1g1.5mLEP2-5mL，靜10000rpm（1.5mLEP設計引物序列PHV-F:5’-GGGACGCTCTGATTAAGGAAT-3’PHV-R:5’-CTTGGTGATCAGCAGCAGCTTG-3’DNA血清或病毒液，常規(guī)市售DNA提取試劑盒提取DNA，取提取液進行PCR擴增。PCR25μL10×Buffer2.5μL（Mg22.0mmol/L），dNTPs2μLExTaq0.5μL（10μmol/L），DNA1μL，ddH2O19.00μLPCR：953min，5345s，72℃3min352％瓊脂糖凝膠配制：稀釋50×TAE1×TAE4g500mL1×TAE200mL20μLEBPCR5V/cmTAEJ.4檢測結(jié)果判定242bp242bp附錄K（規(guī)范性）豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐CoV）RT‐PCR檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐CoV）RT‐PCR檢測原理依據(jù)該病毒的保守N基因設計特異性引物，優(yōu)化反應條件，建立RT-PCR檢測方法。糞便標本采集后，在-80℃下保存，運送至實驗室，進行豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒核酸提取。10分鐘。按照病毒核酸試劑盒說明書進行病毒核酸提取。-80℃保存?zhèn)溆谩GCGTTCTGCGATAAAGCTTAAAACTATTA。10分鐘。按照病毒核酸試劑盒說明書進行病毒核酸提取。-80℃保存?zhèn)溆谩GCGTTCTGCGATAAAGCTTAAAACTATTA。RT‐PCRRT‐PCR30330，35，5530，723072℃5PCRK.4結(jié)果判定以電泳陰性對照為標準，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否有陽性產(chǎn)物。附錄L（規(guī)范性）豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）巢式PCR檢測原理PCR(PCR（）PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCR糞便或鼻拭子/糞便樣本保存于-80℃，鼻拭子樣本進行冷凍處理后，快速轉(zhuǎn)運至實驗室，進行相關(guān)檢測。RNARNARNAPERVR引物TTRCCA。PRCV5μLRNA、5μL10×PCR5μL25mMMgCl2、1μL10mMdNTPs、20URnasin、5UAMV2.5UTaqDNA0.5μL50pmF1R14290，95℃5L.3.594℃，160℃，1.572℃，2.53072℃，10L.3.6第二次反應體系：將PCR產(chǎn)物以1:10稀釋并用作巢式PCR的模板。取1μL稀釋產(chǎn)物與5μL10×PCR5μL25mMMgCl2、1μL10mMdNTPs、2.5UTaqDNA）0.5μL50pmF2R2L.3.7第二次反應條件：94℃，1分鐘；62℃，1.5分鐘；72℃，2.5分鐘，30個循環(huán)，72℃，10分鐘。L.3.8在用溴化乙錠染色的1.5％瓊脂糖凝膠上分析PCRPRCV193–253bp。以電泳陰性對照為標準，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否有陽性產(chǎn)物。附錄M（規(guī)范性）豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測原理PHEVS5FAM3TAMRA，Taq酶發(fā)揮5’→3’PCR豬的腦、脊髓2℃?824h-70℃M.3引物和探針序列信息引物和探針序列信息見表1。表M.1引物和探針序列信息見RNA1.0g0.2mLTRIzol1.5mL無RNase離心管。另取2支1.5mL無RNase離心管，分別加入陽性對照樣品、陰性對照樣品。1mLTRIzol15s10min加入200μL預冷氯仿，振蕩15s，冰上靜置10min。名稱序列（5’-3’）上游引物FCCAGGATAAATTTCTGTGG下游引物RAACCAGGACTAACCTTTGCTaqMan探針（FAM）ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA（TAMRA）4℃高速冷凍離心機12000r/min離心15min。1.5mLRNase-20℃，靜置30min。4℃12000r/min10min1mL75412000r/min5min。棄上清，濾紙吸干殘余液體，室溫干燥2min。加入20μL無RNaseH2O溶解，超微量紫外分光光度計測定核酸濃度。冰浴保存?zhèn)溆谩?℃冰箱保存不超過8h，長期保存應置于-70℃冰箱。M.4.2cDNA2PCR3水浴鍋中水浴110min2min，-20M.4.3反應體系設定PCRM.4.3反應體系設定PCRn133PCR500r/min30s。M.3PCR試劑用量RNA模板1.0μgOligo（dT）18引物（100μmol/L）1.0μL5×MLV緩沖液4.0μLdNTP混合物（2.5mmol/L）4.0μLRNase抑制劑（40U/μL）0.5μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）0.5μL無RNaseH2O補至20.0μL試劑用量10×PCR緩沖液2.0μLdNTP混合物（2.5mmol/L）2.0μL上游引物F（10mmol/L）1.0μL下游引物R（10mmol/L）1.0μLTaqMan探針（FAM）（10mmol/L）1.0μLcDNA模板4.0-40.0ngTaqDNA聚合酶0.5μLM.4.4反應參數(shù)PCRPCRTaqManPHEV——第一階段，預讀50℃2min；——第二階段，預變性95℃3min；——第三階段，95℃15s、60℃30s，40個循環(huán)。熒光收集設置在每次循環(huán)60℃30s時進行。根據(jù)收集的CtCtCt≤30無Ct值并且無擴增曲線，表明樣品中無PHEV核酸，判定為陰性。Ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中存在PHEV核酸，判定為陽性。無Ct值并且無擴增曲線，表明樣品中無PHEV核酸，判定為陰