基于家系的家系wdr-aq-fop多態性與侵襲性牙周炎的關聯研究

所謂牙周炎，是一種與慢性牙周炎顯著不同的牙周炎。臨床表現為早牙、早牙、早葉牙，具有一定的家族聚集能力。病因包括復雜的外源因素(微生物因素與環境因素等)和遺傳因素。流行病學研究顯示,人群中不同個體的易感性有很大差異,這種差異可能主要是由遺傳因素決定的。目前已發現人類多個基因序列的多態性同牙周炎的易感性和牙周組織破壞程度相關,其中維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)是1,25(OH)2D3發揮生物學效應的核內生物大分子,其本質是一種調控細胞內基因表達的轉錄因子。VDR廣泛分布于體內各組織細胞中,參與骨代謝和免疫炎癥反應。一些研究表明,1,25(OH)2D3及其受體VDR的基因多態性不僅與骨關節疾病有關,而且與牙周炎關系密切。學者們發現,與骨代謝有關的VDR基因多態性位點有4個,分別為BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ。近年來,國內外學者對這些位點的多態性與牙周炎易感性的關系進行了研究,但結果不一,可能與樣本量、疾病表型定義、種族差異、環境暴露以及人群分層等因素有關。家系研究可以較好地避免人群分層等因素的影響,被用于多因素疾病的研究中。本課題組以往的研究結果表明,VDRTaqⅠ和FokⅠ位點的單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)可能與中國AgP患者的易感性有關,但這種關聯性有待于在家系人群中得到證實。本研究擬用家系研究的方法對AgP患者及其親屬VDRTaqⅠ和FokⅠ位點的多態性與AgP的易感性進行關聯分析。1數據和方法1.1agp的診斷以2001年7月至2009年6月間在北京大學口腔醫院牙周科門診確診的93例AgP先證者及先證者引薦法(probandinitiatedenrollment)納入的155例一級親屬作為研究對象。本研究已通過北京大學生物醫學倫理委員會的批準,所有研究對象均簽署知情同意書。AgP的確診參照1999年國際牙周病分類研討會所制定的標準,納入條件包括:年齡小于36歲;快速的牙槽骨破壞和附著喪失;全口至少有2顆牙(其中一顆為第一磨牙)的探診深度≥5mm,鄰面附著喪失≥3mm,每名患者均拍攝全口根尖片證實有鄰面牙槽骨吸收;患者除患牙周炎外,全身健康,無糖尿病、心血管疾病和血液疾病等系統性疾病,女性未懷孕或哺乳。親屬的診斷參照1999年牙周病分類法和現狀與回顧性相結合(thecurrentandretrospectivediagnosisandreportedcasehistory)的評分標準對其牙周破壞狀況作出評估診斷,即利用現有臨床證據(包括全口根尖片、全口牙周檢查大表),并結合其口腔既往診療記錄或牙周疾病史對是否患有AgP的可能性進行評分后做出評估。根據其可以診斷為AgP可靠程度的不同,定義為確定、較確定和可能3種診斷類型。由于可能型患者患病的證據相對較少,故在本研究中將可能型患者歸為非AgP。1.2引物和病毒的合成小量外周血基因組DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)、PCR反應相關試劑(包括TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCRbuffer、2000bpDNAmarker,均來自TaKaRa寶生物工程有限公司)、限制性內切酶(TaKaRa寶生物工程有限公司)。用于擴增VDR基因的引物由北京奧科生物技術有限公司合成,TaqⅠ序列為:Fw5′CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG3′,Rv5′GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC3′;FokⅠ序列為:Fw5′AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT3′,Rv5′ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC3′。1.3方法1.3.1保存管理表1圖4采取外周靜脈血1mL,加入含EDTA的抗凝管中,4℃保存。采用上述DNA提取試劑盒提取外周血總基因組DNA,測定濃度和純度,D260nm/D280nm在1.8～2.0之間,-20℃保存。1.3.2熱反應taq和f濱水重性小體制備聚合式總反應體系25μL,其中含模板DNA2ng,引物各10nmol,TaqDNA聚合酶1u,dNTPs各5nmol及相應PCR緩沖液,無菌去離子水補足總體積。TaqⅠ反應條件為:95℃預變性10min后,進行35次循環,循環條件為:95℃變性30s,65℃復性30s,72℃延伸60s;最后72℃延伸7min,擴增得745bp的產物。FokⅠ反應條件為:95℃預變性10min后,進行35次循環,循環條件為:95℃變性30s,65℃復性30s,72℃延伸60s;最后72℃延伸7min擴增得267bp的產物。1.3.3fol制備酶切后fk酶切總體系10μL,其中PCR擴增產物4μL,相應Buffer1μL,0.1%BSA1μL,內切酶5u,加無菌去離子水補足總體積,于37℃水浴消化1h。FokⅠ酶切后,等位基因f顯示61bp、206bp2個片段,等位基因F無酶切位點,仍為267bp。TaqⅠ酶切后,等位基因t顯示290、245和205bp3個片段,等位基因T顯示495和245bp2個片段。1.3.4凝膠成像分析酶切產物10μL,瓊脂糖凝膠電泳,凝膠含溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)替代物GoldViewTM,凝膠成像分析系統觀察結果并分析基因型。分型標準:FF型為267bp1個片段,Ff型為267、206、61bp3個片段,ff型為206、61bp2個片段;TT型為495、245bp2個片段,Tt型為290、245、205和495bp4個片段,tt型為290、245和205bp3個片段。1.4系為基礎的關聯檢驗計量資料用均數±標準差表示,計數資料用百分比表示,分別采用t檢驗和χ2檢驗對這些資料進行各診斷組分布差異的比較。基因多態性與AgP臨床表型的關聯采用以家系為基礎的關聯檢驗(familybasedassociationtest,FBAT)的方法。應用的統計學軟件是SAS8.0。FBAT方法是以核心家系為單位計算每個核心家系數的基因型的分布概率和統計量“S”(統計量S為表型T與基因型X的乘積),然后累加各核心家系的統計量S及S的方差與協方差,進行卡方檢驗,該方法適用于家系資料不完全及一些親代表型資料缺失的情況,需要用一定的遺傳模型描述遺傳表型中基因的效應,本研究分別采用顯性、隱性、加性遺傳模型進行檢驗。2重復實驗的結果樣品提取、PCR擴增和酶切均獲成功,隨機抽取10%的樣本(共25個)進行重復實驗,結果顯示100%相同。基因型測定的典型電泳結果見圖1、2。2.1核心家系研究領域155例血緣親屬中的成員組成為:父親61例,母親51例,同胞43例,屬于核心家系研究。研究對象的基本資料如表1所示,先證者及其親屬的性別比均為女性偏高,先證者中男女性別比為1∶1.91(32/61),同胞中男女比例1∶1.39(18/25)。2.2研究對象的基因型分布研究人群的T和t等位基因頻率分別為94.6%和5.4%。未發現tt基因型,93個先證者中Tt基因型共有10人,其中3人父親為Tt基因型,母親為TT基因型,因此先證者的t等位基因來自父親;另外3人父親為Tt基因型,母親未知,但母親是Tt基因型的概率為3.3%(表1),因此t等位基因來自母親的概率小于或等于3.3%,而來自父親的概率大于或等于96.7%;其余4人未知。此外,AgP先證者父親t等位基因頻率顯著高于母親,9.8%vs1.6%,χ2=7.742,P=0.005,其余各親屬組以及先證者TaqⅠ等位基因/基因型的分布差異無統計學意義(表1)。研究人群的F和f等位基因頻率分別為57.1%和42.9%。FokⅠ等位基因/基因型在各親屬組以及先證者中的分布差異無統計學意義(表1)。2.3隱性3種遺傳模型檢驗未發現VDR基因各位點的多態性與AgP存在具有統計學意義的關聯,即VDRTaqⅠ和FokⅠ各等位基因在加性、顯性及隱性3種遺傳模型的檢驗中,P值均大于0.05(表2)。將先證者按性別分組后進行VDRFokⅠ位點多態性的FBAT檢驗,結果在加性、顯性及隱性3種遺傳模型的檢驗中,差異亦無統計學意義。當把所有AgP患者按照全口牙槽骨吸收特點進行亞型分型(分為以局限型破壞為主型和廣泛型兩組)后進行FBAT檢驗,結果兩組均未發現VDRFokⅠ基因多態性與AgP的關聯。3vdr基因多態性與agp關聯研究本研究中93例先證者的男女性別比為1∶1.91,存在較明顯的性別差異,可能與其他研究所報道的因牙齒原因就診的女性多于男性而導致研究對象選擇的偏倚有關,而并非疾病所致。AgP先證者家屬的診斷一直是AgP家系研究的難題,本研究對于AgP先證者家庭成員的診斷,借鑒Hodge等現有檢查與病史回顧性相結合的評分標準對其牙周破壞狀況作出評估診斷。所有先證者都有全口牙周檢查記錄和X線片的全面診斷,絕大部分親屬也都有X線診斷、全口的牙周檢查記錄大表,在此基礎上結合病史對其進行評分做出評估診斷,最大限度地提高診斷準確性,使對結果的影響降到最低。侵襲性牙周炎作為一種多因素疾病,存在一定的家族聚集性,提示個體的遺傳因素是影響宿主反應性的重要因素,所以對于牙周病遺傳因素的研究一直被廣為關注,而家系研究一直是遺傳學家及臨床醫師公認的識別可疑致病因素及異質性的最好的研究策略。以往的學者通過系譜分析、分離分析以及連鎖分析進行了AgP遺傳模式的探索和基因定位,結論不一,主要原因是上述方法對于多基因疾病的檢測能力有限,并且受家系資料完整程度以及家屬診斷的準確程度影響。復雜性疾病是多個微效基因協同作用并與環境因素共同導致的疾病,所以對于復雜性疾病中起微效作用基因的分析現在多傾向于采用效力較高的關聯研究。關聯研究根據對照組的不同分為群體關聯研究和以家系為基礎的關聯研究。群體關聯研究(population-basedassociationstudy)是基于群體中無親緣關系的病例組和表型正常的對照組在某個遺傳標記位點上會出現不同的頻率,故也稱病例-對照研究(case-control),通過兩者頻率的差異就能推測所研究的遺傳標記和某個遺傳病易感位點之間是否存在關聯。肯定存在遺傳標記與疾病關聯的解釋可以歸納為兩種:一種是遺傳標記位點本身就是疾病位點,與多基因遺傳病的發生有關;另一種是遺傳標記位點與疾病發生無關,但是與致病基因位點存在很強的連鎖不平衡(linkagedisequilibrium)。群體關聯易受人群分層的影響,產生假陽性結果,以家系為基礎的關聯研究可以很好的彌補這種不足,排查虛假關聯。以往的病例對照研究發現VDR基因多態性可能與AgP有關聯,但國內外均沒有家系研究的結果對其進行證實,本研究的結果對于VDR基因多態性與AgP關聯的研究起到了驗證和排查假陽性結果的作用。VDRTaqⅠ位點位于VDR基因的第9號外顯子,該位點的多態性改變是C/T改變,不影響氨基酸序列,但研究證實該位點與很多病生理過程有關,例如骨代謝、免疫調節、細胞生長分化凋亡等,因為該位點與VDR基因3′端存在較強的連鎖不平衡(linkagedisequilibrium,LD),并且與3′UTR在同一個單倍體域,該單倍體域長17kb,包括4～9外顯子和3′UTR。以往國內外學者關于VDRTaqⅠ位點基因多態性與AgP關聯的病例對照研究提示t等位基因可能與AgP易感性有關。早在2002年,本課題組孫靖林等關于中國人群的研究納入了24例成人牙周炎、37例早發性牙周炎和39例牙周健康者,結果發現早發性牙周炎中Tt基因型的檢出率顯著高于另外兩組。而Nibali2008年關于高加索人群的研究則提示吸煙組AgP患者TT基因型顯著高于健康對照,而非吸煙組AgP患者與健康對照基因型的分布無顯著差異。由于中國人群的t等位基因頻率低,因此本研究有遺傳信息可以進行FBAT檢驗的家系較少,只有10家,結果顯示TaqⅠ位點的多態性與AgP在3種遺傳模型中不存在具有統計學意義的關聯,因此,有必要擴大樣本,做進一步分析。另外,本研究的結果VDRTaqⅠ位點等位基因t的頻率