中藥治療腦出血后抑郁的機制研究

中風后抑郁是指中風后復發(fā)的抑郁。它的出現(xiàn)影響了中風患者的神經(jīng)功能缺陷和認知功能障礙，增加了中風后的死亡率和自殺率，并長期影響了中風患者的生活質(zhì)量。中藥頤腦解郁方治療腦卒中后抑郁癥臨床上取得較好療效。我們采用中藥頤腦解郁方干預腦出血后抑郁大鼠模型,以5-HT再攝取抑制劑百優(yōu)解做對照,應用免疫組織化學法觀察大鼠腦內(nèi)不同部位5-羥色胺、去甲腎上腺素、酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase,TH)陽性細胞表達的變化,以進一步探討頤腦解郁方治療腦出血后抑郁的機理。1材料和方法1.1體重、體重健康Wistar雄性大鼠,二級,5~6月齡,32只,體重200g±10g。購于維通利華動物試驗中心(合格證編號:SCXK(京)2004-0003)。1.2動物免疫組織化學試劑頤腦解郁方藥(北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定),使用前按照灌胃劑量煎藥濃縮,濃度為0.62g生藥/ml,貯存于4℃冰箱中備用,臨用前加熱。百優(yōu)解(EliLillyandCompanyLimited,生產(chǎn)批號:A019602),按照成人用量(20mg/60kg·d)7倍計算大鼠用量(0.233mg/100g·d)。臨用時溶于蒸餾水中,混勻,濃度為0.233mg/ml。免疫組織化學試劑:北京中山生物技術有限公司兔抗5-羥色胺(5-HT),美國CHEMICON公司兔抗去甲腎上腺素(NE),美國SIGMA公司小鼠抗酪氨酸羥化酶(TH)。武漢博士德生物工程有限公司二抗工作盒、DAB顯色試劑盒。1.3慢性應激測試儀器自制大鼠夾尾瓶;游泳用水箱;HZQ-C空氣振蕩浴(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠);DF-206電熱鼓風干燥箱(北京京通儀器廠);自制大鼠黑白顛倒箱,以上用于慢性應激的刺激。德國Leitz切片機;美國Polyvar萬能顯微鏡;美國Media-cybernetics,Int產(chǎn)Image-ProPlus真彩病理圖像分析系統(tǒng)(version5.0.1.11)。1.4動物分組、給藥與術后管理用10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉后,局部消毒后,固定于SN2型腦立體定位儀上,顱骨鉆孔,按包新民等編繪的大鼠腦立體定位圖譜,定位尾殼核,以前囟為零點,橫坐標向左4mm,縱坐標向后1mm,深度5mm,顱骨鉆孔,將微量注射器針頭垂直插入腦組織左側尾殼核內(nèi),用微量注射器緩注0.5μl膠原酶(sigma,Ⅶ型,0.5unit)到尾殼核內(nèi)。注射完畢留針3min~5min。術后常規(guī)飼養(yǎng)1周后,予慢性不可預見的溫和應激21d,將動物予每周隨機進行夾尾1min、禁水24h、禁食24h、45℃環(huán)境5min、明暗顛倒24h、水平振蕩30min(160次/min)、4℃冰水游泳5min方法刺激,每日采取一種方法進行刺激。連續(xù)3周21d,每種刺激都進行3次。1.5各組大鼠慢性應激的比較首先用Open-field法做行為學評分,選擇得分相近的32只大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥頤腦解郁方藥組(以下簡稱中藥組)和百憂解治療對照組(以下簡稱西藥組),每組8只。正常組每籠飼養(yǎng)4只,模型組、中藥組和西藥組每籠飼養(yǎng)1只。模型組、中藥組、西藥組均接受腦出血手術及21d慢性不可預見性應激。慢性應激刺激結束后,中藥組和西藥組分別接受灌胃給藥中藥頤腦解郁方、百憂解6周。模型組給予蒸餾水灌胃6周,正常組正常飲食飲水。1.6免疫組織化學法檢測腦心肌組織各組大鼠在完成實驗過程后給予大鼠用10%的水合氯醛麻醉(用量為400mg/kg)腹腔注射麻醉,打開胸腔經(jīng)左心室插管到主動脈,剪開右心耳,先用預溫的37℃生理鹽水約200ml快速沖洗至流出液為淡紅色,再以預冷的10%甲醛灌注固定30min后,斷頭取腦,放入盛有相同灌注液的瓶中固定約2周后,常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋、切片,每張切片厚6um,進行測定指標的免疫組織化學法染色。1.7微波加熱修復抗原免疫組化染色用ABC法,步驟如下:(1)切片常規(guī)脫蠟至水。(2)切片入3%H2O2水溶液室溫10min,蒸餾水洗滌3次。(3)切片入0.01M枸櫞酸緩沖液(pH6.0)微波加熱修復抗原。(4)滴加正常羊血清封閉,室溫30min。(5)兔抗5-羥色胺(5-HT,1∶50)、兔抗去甲腎上腺素(NE,1∶200)、小鼠抗酪氨酸羥化酶(TH,1∶400),4℃過夜。(6)生物素化羊抗兔(小鼠)IgG,37℃1h。(7)滴加試劑SABC鏈酶親和素-過氧化物酶復合物,37℃1h。(8)使用DAB顯色試劑盒顯色,鏡下控制反應時間。在步驟(3)、(5)~(7)后均用0.01MPBS漂洗3次,每次5min。陰性對照用正常羊血清代替一抗。1.8陽性細胞密度對免疫組織化學染色結果,每組選取3張切片,每張切片在同一部位選取3個視野,Image-ProPlus真彩病理圖像分析系統(tǒng)(version5.0.1.11)(Media-Cybernetics,Int),統(tǒng)計每個視野中陽性細胞平均光密度(density),平均陽性細胞面積(area)。1.9方差齊性檢驗數(shù)據(jù)用SAS6.12軟件進行分析,先進行方差齊性檢驗,方差齊直接進行方差分析;方差不齊進行參數(shù)替換后,進行方差齊性檢驗,方差齊者進行方差分析。結果以平均值±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間差異采用方差分析(ANOVA/LSD),以P<0.05作為顯著性差異的標準。2結果2.1大鼠海馬ca1-扣帶皮質(zhì)、5-ht陽性細胞表達變化正常組大鼠腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦內(nèi)均有5-HT陽性細胞。5-HT陽性神經(jīng)元胞體大,5-HT表達在細胞的細胞質(zhì)內(nèi),胞漿呈棕黃色,有粗大顆粒,有些神經(jīng)細胞核區(qū)有表達。模型組大鼠腦海馬CA1、扣帶皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)內(nèi)5-HT陽性細胞表達減少,圓形空泡樣,分布稀疏,顏色淺淡,面積下降,光密度下降,與正常組比較有統(tǒng)計學顯著性意義(P<0.05)。西藥組海馬CA1、扣帶皮質(zhì)表達面積增多,顏色變深,與模型組比較有統(tǒng)計學顯著性差異(P<0.05)。中藥治療組5-HT陽性細胞在海馬CA3、梨狀皮質(zhì)表達增多,與模型組比較有統(tǒng)計學顯著性差異(P<0.05,見表1)。2.2對腦膠質(zhì)瘤大鼠臟器th陽性細胞表達的影響TH陽性細胞主要表達在未定帶和下丘腦,酪氨酸羥化酶表達在神經(jīng)元的細胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,胞漿表達,也存在深棕色的纖維樣表達。模型組下丘腦TH陽性細胞表達減少,顏色變淺,陽性細胞面積、光密度下降與正常組比較有統(tǒng)計學明顯差異(P<0.05)。西藥組可增加下丘腦TH陽性細胞的表達面積,與模型組比較有統(tǒng)計學顯著差異(P<0.05)。中藥組可增加下丘腦TH陽性細胞的表達面積和表達顏色,與模型組比較有統(tǒng)計學顯著差異(P<0.05,見表2)。2.3各組大鼠扣帶皮質(zhì)和臟器組織形態(tài)變化的比較正常組大鼠腦皮質(zhì)和下丘腦內(nèi)有NE陽性細胞表達,在腦皮質(zhì)內(nèi)可見I~VI層均有NE陽性細胞,但主要集中在Ⅱ~Ⅳ。去甲腎上腺素表達在細胞的細胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,核區(qū)也有表達,同時血管壁也有表達。模型組大鼠扣帶皮質(zhì)和下丘腦內(nèi)NE陽性細胞顏色變淺,呈空泡樣,平均陽性細胞光密度下降,較正常組明顯減弱(P<0.05)。西藥組在扣帶皮質(zhì)和下丘腦表達面積增多,顏色加深。中藥組在扣帶皮質(zhì)、下丘腦內(nèi)NE陽性細胞表達面積增多,顏色加深,與模型組比較有統(tǒng)計學顯著性差異(P<0.05,見表2)。3不同腦損傷對psd的影響腦出血后抑郁癥是一種器質(zhì)性情感障礙,其通常緩慢起病,病程遷延。腦內(nèi)單能神經(jīng)功能低下是構成腦出血后抑郁的病理生理基礎。目前研究表明,腦內(nèi)5-HT、NE含量下降,神經(jīng)傳導通路受損可引起腦卒中后抑郁的發(fā)生,與腦卒中后抑郁癥產(chǎn)生相關的腦定位損害主要的是額葉/顳葉-基底節(jié)-腦干腹側這一環(huán)路。Vataja等通過對109例PSD患者顱腦MRI研究表明,左額葉皮層下環(huán)路、尾狀核、丘腦、內(nèi)囊膝部的病變與PSD的發(fā)生密切相關。近來,越來越多的學者認為額葉基底部的病變與PSD的關系更為密切。大腦損傷的不對稱性對PSD的發(fā)生有影響,左側大腦半球損傷與抑郁有關,其中左側額葉和左側基底節(jié)損傷病人的PSD發(fā)生率更高,Mayberg等應用正電子發(fā)射斷層檢測急性腦卒中后抑郁患者時發(fā)現(xiàn),患者中樞內(nèi)5-HT和NE遞質(zhì)水平低下。呂路線研究顯示,腦脊液單胺類遞質(zhì)水平與抑郁程度呈負相關。鐘明奎研究在大鼠基底外側杏仁核中增加5-HT可使大鼠開野實驗自主活動增加,改善抑郁狀態(tài)。TH是兒茶酚胺(多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素)合成的限速酶。酪氨酸羥化酶表達下降則可直接引起兒茶酚胺合成下降。兒茶酚胺合成的短周期調(diào)節(jié)是TH酶活性的調(diào)節(jié)。長周期調(diào)節(jié)是TH酶蛋白量的調(diào)節(jié),是通過TH酶蛋白數(shù)量增加,是在神經(jīng)元胞體水平進行,作用發(fā)生慢而持久。頤腦解郁方,臨床上起到了改善患者抑郁證候的效果。本研究顯示,腦出血后抑郁模型腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、扣帶皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)內(nèi)5-HT陽性細胞表達減少,下丘腦TH陽性細胞表達減少,扣帶皮質(zhì)和下丘腦內(nèi)NE表達減少。