抗苗勒管激素及其型受體基因多態性與卵巢儲備功能的相關性

抗育苗激素（pmh）也被稱為反育苗激素（mis），是從卵巢細胞中轉化而來的生長因子之一。本課題組前期研究不同卵巢儲備功能患者血清中AMH水平表達發現:多囊卵巢綜合征(PCOS)患者血清AMH水平顯著升高,而卵巢早衰(POF)患者血清AMH水平極低,甚至檢測不到。說明血清AMH水平在不同卵巢儲備功能患者中的表達存在差異,而AMH主要是通過與其Ⅱ型受體(AMHRⅡ)結合發揮生物學效應的。故此推測AMH及AMHRⅡ基因多態性在不同卵巢儲備功能患者中也存在差異。本研究檢測AMH及其AMHRⅡ基因在不同卵巢儲備功能患者中的表達情況,并比較不同基因型患者的年齡、BMI及激素指標。1數據和方法1.1生殖醫學中心研究對象均選自2010年6月～2011年8月就診于寧夏醫科大學附屬總醫院生殖醫學中心患者。本研究由該院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。1.1.1診斷標準及診斷標準嚴格按照2003年5月在荷蘭鹿特丹會議上推薦的PCOS診斷標準:①少數或無排卵;②臨床和(或)生化有高雄激素表現;③超聲檢查發現多囊性卵巢和除外其他疾病(腎上腺皮質增生、庫欣綜合征、雄激素分泌腫瘤等);上述3條中符合2條。1.1.2血清fsh140歲以前出現至少4個月閉經;2次或以上血清FSH>40U/L,E2<15pg/mL(2次檢查間隔1個月以上);泌乳素(PRL)、甲狀腺及腎上腺功能正常。1.1.3正常比較因單純輸卵管因素或(和)單純男方因素引起不孕,并擬行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的正常排卵婦女。1.2檢測方法1.2.1促采用化學發光法檢測fsh、促成分及prlPCOS患者及正常對照組于月經周期第2～5天空腹采靜脈全血5mL。采用化學發光法測定促卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、血清雌二醇(E2)、雄激素(T)及PRL。并計算體重指數(BMI)=體重(kg)/身高(m)2。1.2.2反應程序及程序①DNA的提取:采用試劑盒提取DNA方法,并嚴格按照試劑盒說明進行(本次試驗試劑盒由天根生化科技有限公司提供);②AMH和AMHRⅡ部分基因序列PCR擴增:PCR反應總體積25μL,包含2.5mmol/L的dNTP2μL,10mmol/L上游引物1μL,10mmol/L下游引物1μL,rTag聚合酶0.2μL,10×rTaqbuffer2.5μL,DNA2μL,H2O16.3μL;AMH擴增反應程序為95℃變性5min后,95℃30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共30個循環,72℃延伸5min,4℃forever。AMHRⅡ擴增反應體系及程序與AMH相同,其退火溫度為55℃。反應完成后,取5μL用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產物的擴增情況。AMH引物序列為:上游引物5′-CCTTCCACTCGGCTCACTTA-3′,下游引物3′-TCCTCCAGGTGTAGGACCAC-5′,擴增片段長度430bp;AMHRⅡ引物序列為:上游引物5′-CCCTTTGGAAGAGTGGTGAG-3′,下游引物3′-AGGTGGGAGTGA-ATGCAGAG-5′擴增片段長度190bp。③PCR產物純化:嚴格按照Millipore公司96孔純化板操作流程操作。④測序:本實驗PCR產物測序是由華大基因測序部承擔完成,自動測序儀型號:ABI3730XL,其中AMH采用正向測序,AMHRⅡ采用反向測序。具體測序結果見圖1。1.3治療前后s組、正常組及pof組間比較基因型及等位基因頻率采用直接計數法。AMH及AMHRⅡ基因型分布在PCOS組、正常組及POF組均符合Hardy-Weinberg平衡。分類變量進行卡方檢驗,連續變量進行正態性檢驗,組間均數比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異具有統計學意義。所有分析均采用SPSS13.0統計軟件。2結果2.1組正常對照組、pcos組間、pof組間比較表1AMH基因型及等位基因頻率在3組研究對象中分布存在差異性(P=0.006,P=0.019)。AMH基因型分布經兩兩比較后可知:正常對照組與PCOS組間、POF組間均存在差異(P=0.013,P=0.001);PCOS組與POF組間差異無統計學意義(P=0.082)。AMH等位基因頻率分布經兩兩比較可知:POF組與正常對照組、PCOS組間均存在差異(P=0.006,P=0.041),而正常組與PCOS組間差異無統計學意義(P=0.409),見表1。2.2各組間基因型分布3組研究對象AMHRⅡ基因型分布存在差異(P=0.012)。經兩兩比較可知:POF組與正常組、PCOS組間基因型分布均存在差異(P=0.011,P=0.023);而正常組與PCOS組間基因型分布差異無統計學意義(P=1.000)。3組研究對象AMHRⅡ等位基因頻率分布無差異(P=0.1250)。見表2。2.33fsh、eh、e、prl無關關PCOS組AMH基因型分布類型與BMI、LH、T有關(均P<0.05),而與年齡、FSH、E2、PRL無關(均P>0.05);正常對照組、POF組基因型分布與以上各指標均無關(均P>0.05),見表3。2.43年齡、fsh、lh、prl無關者pPOF組基因型分布與BMI、E2及T有關(均P<0.05),而與年齡、FSH、LH、PRL無關(P>0.05);而PCOS、正常組基因型分布與以上各指標均無關(均P>0.05),見表4。3amh基因多態性與卵巢儲備功能的關系AMH是由二硫鍵連接而成的糖蛋白二聚物,有3種受體類型,分別為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。目前已明確人類AMH通過Ⅱ型受體發揮作用,其主要作用是通過連接AMH的Ⅰ型受體(AMHRⅠ)傳遞AMH信息。近年來有學者在基因水平研究PCOS及POF發病機制發現:PCOS及POF的發病與其關鍵基因的多態性有關。其中Kevenaar等對PCOS患者AMH和AMHRⅡ的多態性研究分析發現,AMH及其Ⅱ型受體的基因多態性與PCOS發生相關,且AMHIle49Ser的突變與PCOS的表型密切相關,而POF的發病與卵巢功能早衰基因(ACVR1)的多態性相關。本研究證實了Kevenaar等的觀點,并發現在PCOS和POF患者中其AMH基因表型以T/T為主,在正常對照組中以G/T表型為主,且PCOS組和POF組間基因表型分布無差異,這說明卵巢儲備功能變化與AMH基因多態性密切相關。AMHRⅡ在3組研究對象中其表型均以A/A型為主,但是POF患者中A/T比例(37.50%)明顯高于其他兩組,且POF組未檢測到T/T基因型,這說明卵巢儲備功能減低與AMHRⅡ基因突變有密切聯系,而正常對照組與PCOS組間基因型分布差異無統計學意義,這與國外學者Sproul等的研究結果一致。通過對AMH及AMHRⅡ等位基因頻率分布研究發現,94例正常女性的AMH等位基因G和T分布分別是53.19%和46.80%,而Kevenaar等報道的德國和荷蘭正常排卵婦女AMH等位基因G和T分布是73.16%和26.14%,提示中國人和歐洲人的AMH等位基因頻率分布不同。而AMHRⅡ等位基因頻率在中國漢族人和歐洲人的頻率分布相似,不存在人種差異,本研究亦證實此觀點。本次研究發現AMH的基因型與PCOS患者BMI、LH、T之間存在關系(均P<0.05),而與患者年齡、FSH、E2、PRL水平無關,這與我國學者李鍵等的研究一致,說明在PCOS患者中AMH的G/T表型可能與PCOS患者性激素水平異常、高雄激素血癥及代謝紊亂密切相關。同時還發現AMHRⅡ的A/T基因表型與POF患者