復(fù)元膠囊對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨的保護作用

骨關(guān)節(jié)炎（oa）是一種常見的慢性和進展性關(guān)節(jié)疾病。最典型的病理特征是關(guān)節(jié)軟骨的損傷。研究表明OA軟骨破壞以Ⅱ型膠原和蛋白多糖破壞丟失最明顯,并伴隨軟骨膠原表型的改變-軟骨細胞去分化后合成Ⅰ型膠原。復(fù)元膠囊是由臨床治療OA有效的復(fù)元湯化載加工而成。前期研究表明復(fù)元膠囊能改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者癥狀,降低骨關(guān)節(jié)炎患者血清HA水平,調(diào)節(jié)兔膝OA軟骨中MMPs/TIMPs的比例,抑制軟骨退變。本實驗采用Hulth法建立OA模型,觀察復(fù)元膠囊對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白多糖的影響,探討其對維持正常膠原表型、保護軟骨的作用機理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量250~300g。動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(渝)2002007。1.1.2特效藥復(fù)元膠囊由淫羊藿、鹿茸、肉蓯蓉、川芎、當(dāng)歸等組成,委托重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊。四環(huán)素由鄂州市武昌魚生物制藥有限公司生產(chǎn)。1.1.3主試劑Ⅰ、Ⅱ型膠原多克隆抗體、SABC試劑盒及DAB顯色劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供。1.1.4主要設(shè)備微量移液器、37℃水浴箱、BCD-1650rongsheng冰箱、Olympus光學(xué)顯微鏡,由重慶醫(yī)科大學(xué)免疫組化實驗室提供。1.2方法1.2.1骨關(guān)節(jié)炎模型建立將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、四環(huán)素組、復(fù)元膠囊低、中、高劑量組,每組10只。Hulth法建立骨關(guān)節(jié)炎模型:無菌條件下切斷大鼠右膝內(nèi)側(cè)副韌帶、完整切除內(nèi)側(cè)半月板以及剪斷前后交叉韌帶。術(shù)后肌注青霉素抗感染,共5d。術(shù)后1w開始,每天驅(qū)趕大鼠跑步30min,共驅(qū)趕12周。而正常組不作任何處理。1.2.2復(fù)元膠囊的量依據(jù)Meeh-Rubner公式計算大鼠的等效給藥劑量,復(fù)元膠囊低、中、高劑量組分別給予復(fù)元膠囊371.65mg/(kg·d)、743.30mg/(kg·d)、2229.90mg/(kg·d),四環(huán)素組予四環(huán)素50mg/(kg·d),正常組、模型組予生理鹽水灌胃,于術(shù)后第2周開始,每天灌胃1次,共12周。1.2.3樣品的采集和處理12周后,切取右膝股骨內(nèi)側(cè)髁,4%多聚甲醛固定,10%EDTA脫鈣,常規(guī)石蠟包埋后切片,留作甲苯胺藍染色及免疫組化染色。1.2.4免疫-檢測免疫(1)甲苯胺藍染色軟骨蛋白多糖:切片常規(guī)脫蠟至水,0.1%甲苯胺藍染色30min,入1%醋酸分化5s,烘干、透明、封片。(2)免疫組化SABC法染色Ⅰ、Ⅱ型膠原:切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶20min,復(fù)合抗原修復(fù)液抗原修復(fù)10min,正常山羊血清封閉,滴加Ⅰ、Ⅱ型膠原多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃過夜,滴加生物素化二抗37℃、20min,DAB顯色顯微鏡下觀察,蘇木精復(fù)染1min,烘干、透明、封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果并照片,采用Image-ProPlus圖像分析軟件計算陽性染色平均光密度(IOD)。1.3統(tǒng)計分析2結(jié)果2.1染色架構(gòu)上甲苯胺藍染色正常組軟骨表面平整,甲苯胺藍染色均勻;模型組軟骨表面不規(guī)則,甲苯胺藍染色極度不均,表、中層失染;四環(huán)素組軟骨染色較模型組均勻,表層失染;復(fù)元膠囊各組軟骨染色較四環(huán)素組均勻,各層未見明顯失染。見圖1。2.2各組小鼠材料的染色Ⅱ型膠原正常組全層軟骨可見均勻染成棕褐色;模型組表、中層失染,而鈣化層染色加深;四環(huán)素組表層失染,其余層可見不均勻著色;復(fù)元膠囊各組染色較四環(huán)素組均勻。Ⅰ型膠原正常組軟骨未見著色;模型組表、中層見有不規(guī)則的著色,染色為淡褐色;四環(huán)素組及復(fù)元膠囊各組較模型組淡染。見圖2、圖3。2.3各組大鼠血清中型膠原的表達情況蛋白多糖及Ⅱ型膠原模型組顯著低于正常組(P<0.01);各藥物組高于模型組(P<0.05);復(fù)元膠囊各組較四環(huán)素組高(P<0.05)。Ⅰ型膠原模型組顯著高于正常組(P<0.01);各藥物組低于模型組(P<0.05);復(fù)元膠囊中高劑量組低于四環(huán)素組(P<0.05)。見表1。3討論3.1小鼠骨髓蛋白多糖的染色蛋白多糖是關(guān)節(jié)軟骨重要的細胞外基質(zhì)成分,其漸進性丟失是OA的主要病理表現(xiàn)。甲苯胺藍能將軟骨蛋白多糖染成紫色或紫紅色,而其余組織呈不同程度的藍色。實驗顯示OA時軟骨蛋白多糖丟失明顯,而復(fù)元膠囊各組軟骨蛋白多糖明顯增加,提示復(fù)元膠囊可能有防止軟骨蛋白多糖丟失的作用。3.2小鼠軟骨三種免疫組化后的三性染色反應(yīng)許多研究表明在進行性骨關(guān)節(jié)炎中,軟骨基質(zhì)中II型膠原蛋白表達下降。實驗發(fā)現(xiàn)模型組軟骨II型膠原表達降低,尤其是表、中層失染,這可能提示OA時軟骨破壞從表層軟骨開始,而鈣化層染色加深可能是軟骨對損傷的一種修復(fù)。實驗結(jié)果與LahmA等一致。3.3軟骨細胞的分化和合成型膠原I型膠原主要存在于骨、皮膚等組織,正常關(guān)節(jié)軟骨不含I型膠原。骨關(guān)節(jié)炎時,軟骨細胞去分化后合成Ⅰ型膠原,這是骨關(guān)節(jié)炎疾病進程的一個重要因素。軟骨中產(chǎn)生的I型膠原不能完成正常II型膠原的生理功能,最終導(dǎo)致了軟骨的破壞。3.4復(fù)元膠囊維持正常膠原表型的作用復(fù)元膠囊是治療骨關(guān)節(jié)炎有效的復(fù)方實驗制劑,具有補益肝腎、益氣活血之功,臨床顯示其對OA有明顯療效。本實驗研究發(fā)現(xiàn):復(fù)元膠囊能增加骨關(guān)節(jié)炎軟骨中II型膠原和蛋白多糖表達,同時抑制I型膠原表達,對維持正常膠原表型,保護關(guān)節(jié)軟