結核分枝桿菌耐吡嗪酰胺和乙胺丁醇的pnca和embb基因突變分析及治療對策

目前，抗病性的藥物條件非常嚴重，已成為核電站的治療領域的難題。傳統的結核菌藥敏試驗已不能滿足臨床早期開展有效化療的需要。利用基因分析方法,快速的反應結核分支桿菌基因突變情況。本文通過分析106株臨床分離株的傳統藥敏實驗和embB、pncA基因,研究embB、pncA基因突變與耐EMB和PZA藥物之間的關系,精確地反映患者的耐藥情況,為臨床治療提供依據。1pcr擴增產物結核分支桿菌標準株來源于中國藥品生物制品鑒定所;106例耐多藥肺結核和對照組20例來源于我院住院患者。以上病例治療前后均做培養和藥敏,Bactec培養增菌、菌種鑒定和藥敏試驗:按“結核病診斷細菌學檢驗規程”進行分支桿菌培養、菌種鑒定和藥敏試驗。EMB、PZA的高、低耐藥濃度標準分別為50、5、250和50mg/L。將分離株進行前處理后提取DNA,置-20℃保存備用。在25μl反應體系中,4種dNTP的終濃度各為0.2mmol/L,引物1、2的終濃度各為0.4umol/L,純化的DNA模板10～100ng,TaqDNA聚合酶1μ。置DNA熱循環儀擴增后,在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增產物。結核分支桿菌16SrRNAl23-275位核苷酸(按大腸桿菌16SrRNA的編碼位置)是原核生物高度變異的區域,擴增該區域272bp片段,在8%(29:1)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,由于不同種細菌DNA單鏈的空間構象不同,電泳后片段的遷移率也就不同,而呈現出不同的電泳圖譜。與結核分支桿菌標準圖譜相似的分離株判定為結核分支桿菌復合群;與其圖譜不同的分離株判定為非結核分支桿菌。根據結核分支桿菌embB基因序列(基因庫EMBL編號U68480)設計、合成的引物可擴增embB基因產生365bp片段。pncA基因序列(genebankaccessionnumbleU59967)設計P1和P2可擴增該基因32-313位堿基產生282bp片段(pncA上游)。引物P3和P4可擴增該基因265-512位堿基產生248bp片段(pncA下游)。PCR擴增產物在6%(59;1)。非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,銀染色后觀察結果并照相。與結核分支桿菌標準株單鏈DNA遷移率相同的為野生型,出現泳動變位的為突變型。耐多藥肺結核進行個體化化療方案治療,對照組進行普通化療,化療療程為三個月。2embc基因106株分支桿菌分離株經傳統菌種鑒定為結核分支桿菌;傳統藥敏試驗結果顯示,94例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)藥物株中,高耐藥37株,低耐藥57株。83例TB菌耐乙胺丁醇(EMB)高耐藥53株,低耐藥30株。隨機選94株耐多藥分支桿菌分離株,經PCR-SSCP菌種鑒定分析,均與結核分支桿菌標準株的電泳圖譜相似,進一步證明為結核分支桿菌。分析94例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)的pncA基因突變率為44.69%(42/94),其中pncA上突變率為30.9%(29/94),pncA下突變率為12.7%(12/94)。還發現1株pncA上和pncA下同時突變株。耐乙胺丁醇(EMB)的embB基因突變率為54.2%(45/83),兩種基因同時突變率為11.8%(11/94),其中embB基因均在傳統藥敏的高耐藥區域。高耐藥37例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)中,pncA基因突變率為75.6%(28/37),占總體的35.1%(33/94);其中pncA上突變率為43.2%(16/37),pncA下突變率為29.7%(11/37),有1株pncA上和pncA下同時突變株2.7%(1/37)。PZA低耐藥57例中,pncA基因突變率為24.6%(14/57),占總體的9.5%。其中pncA上突變率為22.8%(13/57),pncA下突變僅1例。embB基因突變均在傳統藥敏的高耐藥區域,低耐藥30株未見突變。選擇耐多藥住院病人進行Bactec培養增菌、菌種鑒定和不同梯度藥敏試驗和embB、pncA耐藥基因分析,根據大量檢驗得出的第一手材料,分析embB、pncA突變與臨床治療的關系,有針對性地建立個體化化療方案。建議方案有:2·5·1單藥H、R、E、S均低耐藥者,而聯合用藥敏感,可繼續采用聯合用藥治療。2·5·2單藥中E、P高耐,并有基因突變,停E、P,改用H、O、R、K為主的聯合用藥治療方案,另加免疫調節劑。2·5·3E高耐,并有基因突變,改用K、O、P為主和HRS的聯合用藥治療方案,另加力克肺疾或丙硫異煙胺等藥物。2·5·4藥E、P低耐,但無耐藥基因突變,還可堅持以HRE為主的聯合用藥,并加O、S、K、P等一項單藥物及免疫調節劑治療。2·5·5聯合藥敏發現P有低耐,并有耐藥基因突變,但HRE或HRS聯合用藥敏感,決定在HRE或HRS基礎上,去掉P,加O、1321、丙硫異煙胺和免疫調節劑治療的治療方案。經過治療前后對比分析,痰菌轉陰率為65.9%(62/94),病灶治療有效率為69.1%(65/94),空洞治療有效率為56.4%(53/94),與對照組有明顯的差異。3e研發prca突變吡嗪酰胺(PZA)是一種煙酰胺類藥物,它在體外酸性條件(pH5.0～5.5)下,具有抗分支桿菌活性,可能PZA是一種具有抗分支桿菌活性復合物(如吡嗪酸)的前身,在分支桿菌吡嗪酰胺酶的作用下,在細胞內轉變成吡嗪酸而發揮殺菌作用,當吡嗪酰胺酶編碼基因pncA突變后,使吡嗪酰胺酶活性喪失,而產生耐藥現象,結果分析94例TB菌耐PZA的pncA基因突變率為44.69%(42/94)。另實驗發現pncA基因突變以高濃度突變為主,占35.1%(33/94),低濃度耐藥株大部分不突變,僅有9.5%突變。在突變株中以pncA上突變為主,突變率為30.9%(29/94)。pncA下突變也較常見,突變率為12.7%(12/94)。在低濃度中pncA下突變較少見,94株中發現1株pncA上和pncA下同時突變株。pncA基因突變是結核分支桿菌耐PZA的主要基因,且基因突變與耐藥水平是有關系的,還有部分高濃度和大部分低濃度沒有基因突變,提示可能存在其它耐藥因素。乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)是1961年發現的一種具有抗分支桿菌活性的合成藥物,是第一線抗結核藥物。最近的研究表明結核分支桿菌耐EMB與阿拉伯糖基轉移酶的編碼基因embABC操縱子突變或emb蛋白過度表達有關,該操縱子由embC、embA和embB三個基因組成,其中embB基因(尤其是306位密碼子)突變是耐EMB產生的主要原因。結核分支桿菌embB基因約3246bp,編碼一個糖基轉移酶,embB基因突變使糖基轉移酶結構改變,影響了EMB和糖基轉移酶的相互作用,而導致耐EMB的產生.通過PCR-SSCP技術分析了45株結核分支桿菌耐EMB分離株embB基因7597位至7961位堿基(編碼215位至336位氨基酸),突變率為54.2%。大多數結核分支桿菌耐EMB是由于embB基因突變所致,少數是由于embC和embA突變所致。21.1臨床分離植物的傳統細菌鑒定及藥物過敏試驗結果22pcr-scp初步鑒定23rc-scp分析中的ebam基因24-vmmm、ppca突變與藥物過敏試驗之間的關系25pmmm、pcna突變與臨床治療之間的關系1·615pcr-scp分析、eit和pcla基因14pcr-scp初步鑒定13結核菌dna的制備和pcr擴增1·21傳統藥敏不同耐藥期對embc基因的影響通過PCR-SSCP方法分析結核分支桿菌臨床分離株的embB基因,可快速檢測部分結核分支桿菌E