microrna對人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的影響

視障母親（rb）是兒童最常見的核電站視覺腫瘤。調查顯示5歲以下兒童RB發病率高達11.8/100萬,占同齡兒童惡性腫瘤的6.1%。在我國臺灣,RB的5年生存率為81%,其中雙眼RB5年生存率僅64.3%。流行病學研究中發現,我國RB診斷滯后,化學減容治療效果不佳,很多患者最終不得不接受眼球摘除術來控制腫瘤的發展,這主要是由于部分RB表達多種耐藥相關蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),多藥耐藥相關蛋白(multi-drugrelatedprotein,MRP)、肺耐藥蛋白(lungresistanceassociatedprotein,LRP)等,因而對化療不敏感。惡性腫瘤對化療的多藥耐藥性是大多數惡性腫瘤化療效果不佳最主要的原因。現在越來越多的證據表明,microRNA不但廣泛參與各種腫瘤的發生發展與復發轉移,而且與腫瘤耐藥性的產生有關。這些研究都指出:microRNA與腫瘤干細胞的侵襲性和耐藥性密切相關,調控microRNA可以抑制腫瘤干細胞的耐藥性,提高其對化療的敏感性。為探究MicroRNA調控人RB腫瘤干細胞多藥耐藥性的機制,本研究組做了相關研究,現報道如下:1材料和方法1.1抗菌藥物的檢測Y79細胞(由西安交通大學醫學院眼科實驗室提供),含10%胎牛血清1640培養基、無血清化學限定培養基、10%FBS:1640培養基、抗-ABCG2抗體、IgG2a抗體、山羊抗鼠FITC二抗、MTT試劑盒、Signosisnorthernblot試劑盒、熒光素酶測試試劑Ⅱ。實驗用抗腫瘤藥物為長春新堿、依托泊苷和卡鉑。長春新堿濃度梯度為0.1、1.0、10μg/mL,依托泊苷濃度梯度為0、50、100μmol/L,卡鉑濃度梯度為0、50、150μmol/L。長春新堿、依托泊苷和卡鉑的血漿峰濃度(PPC)分別為5.0、2.0、1.0μg/mL。1.2實驗方法1.2.1運行各組abcg2+細胞的培養用含10%胎牛血清1640培養基培養,擴增Y79細胞至8×107個,打碎后重懸至濃度1×107個/mL,無菌條件下與抗-ABCG2抗體于4℃孵育20min,采用IgG2a抗體作為同型對照。PBS洗滌細胞,加入5μL山羊抗鼠FITC二抗,4℃,20min,3~5次洗滌后上流式細胞儀進行分選。分選后實驗組ABCG2(+)細胞用無血清化學限定培養基培養,對照組ABCG2(-)細胞用10%FBS:1640培養基培養,2~3d換液1次,定期傳代。流式細胞法,檢測分選后的ABCG2細胞表達率。1.2.2藥物處理及復孔首先委托ABI公設計合成具有莖環(stemloop)結構的反轉錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針。用Trizol抽提總RNA,將抽提的RNA進行反轉錄的cDNAz作為real-timePCR檢測的模板,加入引物及探針(表1),調整好總體積后加入96孔板,設3個重復板。將分選出的ABCG2(+)與ABCG2(-)細胞稀釋至1×105個/mL,接種于96孔板中,每孔105個細胞。加入不同濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑,每種藥物分三個濃度梯度(長春新堿濃度梯度為0.1、1.0、10μg/mL,依托泊苷濃度梯度為0、50、100μmol/L,卡鉑濃度梯度為0、50、150μmol/L)。每種藥物分設7個復孔,設置對照組和空白組(以營養液代替試劑),培養2d。向每孔分別加入20μLMTT,繼續培養12h,將各個孔中的營養液全部吸出,溶解,振蕩30min,選擇490nm波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值)。1.2.3卡鉑的加入將分選的ABCG2(+)與ABCG2(-)細胞稀釋至1×105個/mL,放入培養箱中進行48h的培養,然后實驗組加入卡鉑(濃度為1.0μmol/L);對照組則不加卡鉑。培養24h后,收集待測細胞,并用3000r/min離心6min,棄上清液,乙醇固定18h后離心,PBS洗滌細胞,加入5μL山羊抗鼠FITC二抗,4℃,20min,3~5次洗滌后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。1.2.4電子標本定位病理科切片,行LRP、MRP1,P-gp免疫組化染色,收集高表達三種蛋白的RB標本6例作為高耐藥組,均低表達的RB標本6例作為低耐藥組;行LNA-原位雜交觀察候選microRNA在高耐藥組和低耐藥組的定位并半定量檢測;蠟塊組織提取RNA,通過realtimePCR觀察候選microRNA在兩組中表達差異。1.3分布計量資料采用統計學軟件SPSS19.0進行分析,正態分布計量資料以均數±標準差(ue0af±s)表示,兩組間計量資料采用t檢驗;計數資料以率表示,采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1abcg2+的評分流式細胞儀分選Y79細胞中ABCG2(+)及ABCG2(-),分選后ABCG2(+)為91.7%,顯著高于分選前(5.7%),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。2.2堿、依托泊苷和卡鉑對abcg2+細胞的耐藥性MTT法檢測ABCG2(+)及ABCG2(-)細胞對長春新堿、依托泊苷和卡鉑的耐藥性。長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到0.1μg/mL時,可殺滅和抑制ABCG2(-)細胞;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到1.0μg/mL時,ABCG2(+)表現出顯著抗藥,說明ABCG2(+)細胞在PPC1.0μg/mL長春新堿、依托泊苷和卡鉑的作用下,依然不受其抑制生長;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到10.0μg/mL水平以上,對ABCG2(+)細胞才出現抑制作用。對比各個濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑對ABCG2細胞的作用顯示,ABCG2(+)細胞有顯著高于ABCG2(-)細胞的耐藥性,差異有統計學意義(P<0.05)。在3種化療藥物中,卡鉑抑制細胞生長的作用最為顯著,尤其對ABCG2(-)細胞的抑制最為明顯。見圖2。2.3abcg2+細胞的凋亡和死后量和卡鉑蓄積量測定應用流式細胞儀,對ABCG2(+)和ABCG2(-)細胞在0、24、48h凋亡率的檢測結果顯示:ABCG2(-)細胞的凋亡率顯著大于ABCG2(+)細胞,且凋亡率與用藥時間有關。ABCG2(-)出現“亞G1峰”,且隨時間發展而累積,說明有越來越多的細胞凋亡和壞死;ABCG2(+)未出現“亞G1峰”,說明ABCG2(+)細胞未出現明顯凋亡和壞死。ABCG2(+)明顯低于ABCG2(-),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。應用流式細胞儀,對ABCG2(+)及ABCG2(-)細胞4、24h時卡鉑熒光強度進行監測(反映卡鉑在細胞內蓄積水平)。峰值及熒光強度表現為:ABCG2(-)細胞峰值右移、平均熒光強度為9.78和15.35,表明細胞內卡鉑蓄積量增加;ABCG2(+)細胞峰值左移、平均熒光強度為4.39和2.17,表明細胞內卡鉑蓄積量減少。ABCG2(+)的藥物蓄積明顯低于ABCG2(-),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。2.4兩組患者的microrna表達率比較通過對RB病理切片中的高耐藥組的與低耐藥組的rt-PCR觀察,發現高耐藥組的microRNA表達率(39.3%)明顯高于低耐藥組的microRNA表達率低(5.2%),差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。3rab腫瘤干細胞調控多藥耐藥性的分子機制視網膜母細胞瘤(RB)是兒童最常見的原發性眼內惡性腫瘤。臨床多表現為瞳孔區反射黃白色光,患兒視力減退,甚至造成斜視。腫瘤組織可通過視網膜進入玻璃體,甚至經淋巴結及血液循環轉移至全身,導致患兒死亡。由于RB的化學減容治療效果不佳,多數患者只能通過眼球摘除術控制腫瘤細胞的增生,造成患兒終身眼疾,嚴重影響了患者的身心健康。有關研究顯示,RB化療效果不佳主要是由于其表達多種耐藥相關的蛋白,包括P-糖蛋白P-gpMRP、LRP等。為提高化療對RB的治療效果,學者開始研究視網膜母細胞多藥耐藥性的機制。研究發現,惡性腫瘤對化療的耐藥性根據耐藥譜可分為原藥耐藥和多藥耐藥(multi-drugresistance,MDR),其中MDR是由一種藥物誘發,但同時又對其他多種結構和作用機制迥異的抗癌藥物產生交叉耐藥,是大多數惡性腫瘤化療效果不佳最主要的原因。腫瘤干細胞(CSCs),具有自我更新和多向分化能力。腫瘤干細胞耐藥這一特征,被認為是腫瘤復發、轉移、多藥耐藥的根源。MicroRNA即小RNA,通過結合靶標mRNA抑制蛋白表達,從而構成了一種新的蛋白表達調控機制。由于microRNA與腫瘤干細胞的侵襲性和耐藥性密切相關,因此調控microRNA可以抑制腫瘤干細胞的耐藥性,提高其對化療的敏感性。為探究MicroRNA調控人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的機制,本研究組通過ABCG2分選RB細胞系Y79中的腫瘤干細胞,結合臨床組織標本篩選RB耐藥相關microRNA并進一步研究其功能,探索RB腫瘤干細胞調控多藥耐藥性的分子機制。本研究結果顯示:(1)分選陽性率:分選前陽性率僅為5.7%,說明ABCG2(+)細胞只是Y79細胞中的含量極少的亞群,通過流式細胞儀分選后陽性率提升至91.7%,有效提高了ABCG2(+)純度,為下一步實驗提供了高純度細胞。(2)分選細胞對長春新堿、依托泊苷和卡鉑的藥物敏感性:長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到0.1μg/mL時,可殺滅和抑制ABCG2(-)細胞;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到1.0μg/mL時,ABCG2(+)表現出顯著抗藥,說明ABCG2(+)細胞在PPC1.0μg/mL長春新堿、依托泊苷和卡鉑的作用下,依然不受其抑制;長春新堿、依托泊苷和卡鉑PPC達到10.0μg/mL水平以上,對ABCG2(+)細胞才出現抑制作用。對比各個濃度的長春新堿、依托泊苷和卡鉑對ABCG2細胞的作用顯示,ABCG2(+)細胞有顯著高于ABCG2(-)細胞的耐藥性,差異有統計學意義(P<0.05)。說明ABCG2(+)細胞對多種化療藥物均有耐藥性,即對化療藥物具有多藥耐藥性。有關研究指出ABCG2可促進細胞排出化學藥,是當今最常用的耐藥標記蛋白之一。有學者利用ABCG2為標志物從RB細胞系和Y79細胞系中分選出了腫瘤干細胞(CSCs),并且發現這種CSCs的自我更新和體內腫瘤形成能力受Wnt/β-catenin通路調節,且對組織的耐藥性有一定影響。(3)流式細胞儀檢測分選細胞的凋亡率和細胞內藥物蓄積(經PPC1.0μg/mL卡鉑處理)應用流式細胞儀,對ABCG2(+)和ABCG2(-)細胞在0、24、48h凋亡率的檢測:ABCG2(-)細胞的凋亡率顯著大于ABCG2(+)細胞,且凋亡率與用藥時間有關。ABCG2(-)組出現“亞G1峰”,且隨時間發展而累積,說明有越來越多的細胞凋亡和壞死;ABCG2(+)組未出現“亞G1峰”,說明ABCG2(+)細胞未出現明顯凋亡和壞死。兩組凋亡率比較,ABCG2(+)組明顯低于ABCG2(-)組,差異有統計學意義(P<0.05);應用流式細胞儀,對ABCG2(+)及ABCG2(-)細胞4、24h時卡鉑熒光強度進行監測(反映卡鉑在細胞內蓄積水平)。峰值及熒光強度表現為:ABCG2(-)細胞峰值右移、平均熒光強度為9.78和15.35,表明細胞內卡鉑蓄積量增加;ABCG2(+)細胞峰值左移、平均熒光強度為4.39和2.17,表明細胞內卡鉑蓄積量減少。ABCG2(+)組的藥物蓄積明顯低于ABCG2(-)組,差異有統計學意義(P<0.05)。進一步說明ABCG2(+)細胞的抗藥性強勁且對化療藥物的蓄積量極低,這一特性提高了ABCG2(+)細胞對藥物的耐藥性。(4)候選microRNA在不同耐藥性RB切片中的表達:通過對RB病理切片中的高耐藥組與低耐藥組的rt-PCR觀察,發現高耐藥組的microRNA表達率(39.3%)明顯高于低耐藥組的microRNA表達率低(5.2%),差異有統計學意義(P<0.05)。有學者指出在視網膜前體細胞中RB基因,P53基因,microRNA-17~92同時表達下降時可以抑制RB的形成,從而抑制耐藥性。由此可以看出microRNA在調節腫瘤干細胞多藥耐藥性中起到了重要作用。綜上所述,microRNA是調控人視網膜母細胞瘤腫瘤干細胞多藥耐藥性的重要因素,可通過調控microRNA來抑制腫瘤干細胞的耐藥性,提高對化療的敏感性,有利于視網膜母細胞瘤患