咖啡因代謝產物及檢測方法研究進展

咖啡因是提取自茶葉和咖啡果實中的一種堿性物質。這種純茶是由白色和強烈苦的粉末組成的。咖啡因屬甲基黃嘌呤生物堿,化學式為C8H10N4O2,化學名為1,3,7-三甲基黃嘌呤或3,7-二氫-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮。自從人們認識到咖啡因的用途以來,咖啡因就被人為添加到多種食品、飲料和藥物中,咖啡因與人類健康息息相關,并在人們生活中占有不可替代的地位。咖啡因適度地使用有祛除疲勞、興奮神經的作用,臨床上用于治療神經衰弱和昏迷復蘇。但是,大劑量或長期使用也會對人體造成損害,特別是其成癮性,一旦停用會出現精神萎頓、渾身困乏疲軟等各種戒斷癥狀,雖然其成癮性較弱,戒斷癥狀也不十分嚴重,但由于藥物的耐受性而導致用藥量不斷增加時,咖啡因就不僅作用于大腦皮層,還能直接興奮延髓,引起陣發性驚厥和骨骼震顫,損害肝、胃、腎等重要內臟器官,誘發呼吸道炎癥、婦女乳腺瘤等疾病,甚至導致吸食者下一代智能低下,肢體畸形,因此也被列入受國家管制的精神藥品范圍。一、-n-脫甲基化降解信號通路咖啡因口服后主要在胃腸道快速而完全的吸收,約在15~60分鐘達峰值濃度,峰值可持續到120分鐘,胃排空延遲是導致峰值變異的主要原因(Benowitz.1990)。當咖啡因由小腸進入門脈循環時,會經過首過消除效應,主要由分布在腸壁和肝臟的細胞色素P450(CYP450)酶作用,之后再進入全身大循環。因為咖啡因首過消除效應較弱,所以咖啡因經吸收后,能完全地進入全身組織并且自由通過血-腦、胎盤、血-睪屏障(Miners等.1996)。咖啡因系統平均清除率約為150ml/min,半衰期為2~4.5小時(Lelo等.1986),有的個體則長達12小時。咖啡因隔夜一般就會被肝臟代謝清除,只有不到5%的咖啡因以原形通過腎臟排泄(Devoe等.1993)。咖啡因體內代謝過程復雜,在尿液中現今已發現咖啡因15種代謝產物,參與代謝過程的酶也逐一證實。口服咖啡因后,首先經3-N-脫甲基化生成17X(副黃嘌呤),為主要代謝產物,約占80%,這一步反應由藥物代謝酶CYP1A2催化(部分由CYP2E1代謝)。此外,咖啡因通過1-N-脫甲基和7-N-脫甲基分別生成37X(可可堿,12%)和13X(膽茶堿,7%),分別由藥物代謝酶CYP1A2和CYP2E1催化完成;13X進一步經3-N-脫甲基化生成1X(1-甲基嘌呤);17X和1X進一步經C-8-羥基化分別生成17U和1U,這兩步反應分別由CYP2A6和黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)催化完成。咖啡因及其代謝途徑詳見圖1。17X為主要代謝產物之一,分子結構與咖啡因相近,在血尿標本中很容易被檢測,幾乎60%的17X是以原型從尿中排泄(Lelo等.1986,Arnaud等.1980,Klebanoff等.1998)。17X的代謝速度與其生成速度相當,相對血漿咖啡因而言,一天中17X的波動水平和變異程度較小,血漿中17X的降解速度比咖啡因要慢,通常服藥后8~10小時,17X的血藥濃度超過咖啡因水平(Arnaud等.1993)。另外兩個主要代謝產物37X和13X在體液及臍帶血中就能被檢測到,它們的半衰期相對較長。37X是咖啡因的主要活性代謝產物,約50%的37X在8~12小時內由尿液排泄(Tarka等.1983)。37X藥理作用包括利尿、刺激心血管系統、舒張平滑肌、增加腺體分泌(Shively等.1985)。37X的代謝主要由CYP1A2參與,幾乎占86%,部分由CYP2E1完成,其半衰期為7.2~11.5小時,37X血漿和腎清除率分別為46%和67%,吸煙人群中血漿清除率一般高于非吸煙人群33%左右(Shively等.1985,Rostami-Hodjegan等.1986,Lelo等.1986,Birkett等.1985,Gates等.1999)。代謝產物13X結構與咖啡因也相近,僅少一個7-N-甲基,其藥理活性相近于咖啡因和37X,但是毒性作用卻強于二者,毒性作用比咖啡因持續時間長3~9小時,但是個體間變異卻比較大(Stavric等.1988)。13X通過肝腎代謝清除,主要代謝酶為CYP1A2,通過3-N-去甲基化反應生成1X以及8-氫化反應生成13U。腎清除率與尿流速和流量高度相關,13X血漿濃度偏高將導致代謝清除率降低并增加腎臟清除率。13X的清除、代謝、排泄,類似于咖啡因,均存在較大的個體差異。常見外源性的影響因素包括:吸煙、病毒感染、心、肝疾患、妊娠、飲食和合并用藥,這些因素均影響13X的代謝和排泄,如吸煙增加其代謝和排泄,懷孕則降低其代謝清除,可以導致13X在體內的聚積,而胎兒和新生兒缺少代謝13X的酶,完全依賴于腎臟的排泄,容易發生咖啡因中毒。二、其他ayp2a6酶在咖啡因代謝的途徑中,有多種藥物代謝酶參與,主要的藥物代謝酶歸納如下:(一)CYP1A2CYP1A2是細胞色素P450氧化酶的一個亞家族,約占肝臟CYP450s酶含量的13%,參與咖啡因、華法林、茶堿、普萘洛爾、美西律、維拉帕米、硝苯地平、他克林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、阿米替林、氟伏沙明和氯氮平等20多種臨床常用藥物的代謝。CYP1A2也參與外源性物質的代謝,介導許多前致癌原或前毒性物質的體內激活,同時也代謝解毒一些有害物質。CYP1A2的活性能被吸煙、多環芳香烴及藥物(如奧美拉唑、卡馬西平)誘導,也可被喹諾酮類抗生素和口服避孕藥抑制。CYP1A2是參與咖啡因初級代謝過程的主要代謝酶,CYP1A2催化咖啡因1-N-和7-N-脫甲基化反應,此外CYP1A2還參與了咖啡因幾個次級代謝產物的生成。CYP1A2同樣也參與了代謝產物17X、37X和13X的N7、N3和N1位脫甲基反應,分別生成1X、7X和3X。此外,CYP1A2還可能參與了17X、37X和13X8-羥化反應,分別生成17U、37U和13U。此外,其他藥物酶如CYP2A6、2E1、3A4也在二甲基尿苷代謝產物的生成中發揮重要作用(Fuhr等.1992,Tang等.1994,Robson等.1988)。(二)CYP2A6CYP2A6是細胞色素酶P450家族中的重要成員之一,完成整個CYP450家族代謝任務的約3%。許多外源性物質包括藥物(如香豆素、丙戊烷、氟烷等)、前致癌原(如亞硝胺、尼古丁、黃曲霉素B1等),以及其他一些化學物質均通過CYP2A6進行生物轉化。同時,CYP2A6也是尼古丁的主要代謝酶,CYP2A6的活性與個體吸煙行為以及吸煙數量相關。CYP2A6基因突變導致CYP2A6酶活性的降低與多種腫瘤疾病存在負相關,例如肺癌、結腸癌、胰腺癌、鼻咽癌等。而影響CYP2A6酶活性的因素多種多樣,年齡、性別、遺傳因素、合并用藥、環境等都均能對CYP2A6活性產生影響。CYP2A6參與了咖啡因代謝產物17X的羥化代謝,生成17U,因而尿中咖啡因代謝比率17U/17X可以應用于CYP2A6活性的評價,該比率增加表明CYP2A6活性增加。(三)N-乙酰轉移酶(N-acetyltransferase)N-乙酰轉移酶參與芳香胺和肼類物質包括2-氨基芴、4-氨基聯苯以及聯苯胺的代謝,外源性的毒物以及臨床用藥包括異煙肼、氨苯砜、普魯卡因胺、磺胺二甲基嘧啶等,因此N-乙酰化反應可以改變藥物活性及降解致癌物質。在咖啡因所有開環的代謝產物中,AFMU及其降解產物AAMU在定量上均具有重要的地位,而N-乙酰轉移酶是影響AFMU生成的主要代謝酶(Kilbane等.1992)。(四)黃嘌呤氧化酶(XO)XO(xanthineoxidase)參與了1X到1U的生成,這是沒有爭議的事實。然而不管是從137X、37X或13X來源的3X,均不代謝為3U(Krul等.1998)。(五)CYP3ACYP3A是人體最為重要的藥物代謝酶,在肝和腸道中含量豐富,約占成人肝臟CYP450酶總量的25%,并且為腸道的主要CYP450酶。CYP3A有多種亞型,在成人體內主要是CYP3A4和CYP3A5。CYP3A在外源性物質,尤其是藥物代謝中起重要作用,臨床中約有60%的藥物由其代謝轉換;同時CYP3A也催化許多內源性物質,例如雌二醇、睪丸酮及可的松的6β-羥化代謝。CYP3A酶活性存在顯著的個體差異性,體外人肝微粒體中CYP3A活性的個體差異達40倍,同樣在小腸及肝微粒體中的差異也很大,導致個體差異的影響因素包括遺傳、環境、生理、病理及飲食等多種遺傳和非遺傳因素。化學及免疫抑制試驗結果證明,CYP3A4主要參與了137X到137U的生成代謝(Tassaneeyakul等.1992)。(六)CYP2ElCYP2E1和其他同工酶參與了137X三種脫甲基化產物17X、13X、37X的生成,其中,相對CYP1A2來說,CYP2E1在13X、37X的生成中可能起主導作用(Gu等.1992)。三、血藥濃度和測定方法關于咖啡因及其代謝產物的檢測,一直以來國內外都有較多的研究報道。然而根據不同的研究目的,咖啡因代謝產物的選取各不一樣,有些研究關注咖啡因和幾個甲基嘌呤代謝產物的檢測,而另外的研究則關注黃嘌呤和尿酸代謝產物的檢測。HPLC-UV/DAD法最常用于血尿標本咖啡因及其代謝產物的檢測,也有HPLC-MS/MS檢測方法的報道,質譜檢測器靈敏度高,離子篩選能力強,特異性高,實現了高通量檢測的需求,能很好的滿足咖啡因及其代謝產物的同時檢測及其定量要求。雖然檢測儀器代代更新,逐步趨向高尖化,性能也在提高完善,但咖啡因及其代謝產物樣本的前處理環節改動較少,其流程基本保持不變,可能的原因是咖啡因及其代謝產物各自的理化性質差異比較大,所以能同時滿足這些物質萃取條件的要求受到了苛刻的限制。四、固相萃取法咖啡因樣本前處理通常采用有機溶劑液-液萃取法,常用的萃取試劑為三氯甲烷/異丙醇混合液(90:10或85:15),三氯甲烷/異丙醇不同的比率影響著咖啡因及其代謝產物的萃取效率,而90:10或85:15的配比較為常用。液-液萃取過程中常需酸化樣本,一是可以穩定樣本中咖啡因的代謝產物,減少生物降解;二是酸化樣本可提高待測物的萃取回收率。除了液-液萃取法外,固相萃取法也是常用的處理方法,固相萃取法節省試劑,在極性強、小分子物質及復雜物質的萃取方面有著較強的優勢。但是固相萃取法的萃取柱造價高,費用貴,使用壽命短,因而消耗大,給普通實驗室樣本的前處理帶來較大的經濟壓力。此外,也有直接沉淀法處理樣本的報道,操作中直接往樣本中加入高氯酸,震蕩離心,再用適當的堿中和多余的高氯酸,然后直接進色譜分析系統分析。方法簡單、快速、低廉,為咖啡因及其代謝產物的檢測提供了一條經濟的樣本前處理方案(Holland等.1998)。此外,尿液標本也可經酸化、甲醇脫蛋白、離心除雜質,取上清進入液相色譜系統檢測。值得一提的是,也有研究中采用攪拌棒吸附萃取(stirbarsorptiveextraction,SBSE)的方法,SBSE是上世紀90年代末Baltussen等發明的一種新型的樣品前處理技術,具有靈敏度高、重現性好、不使用有機溶劑等優點,適用于食品、環境、生物樣品中揮發性及半揮發性有機物的痕量分析。就咖啡因及其代謝產物的萃取方面而言,SBSE提取設備可以大大減少咖啡因及其代謝產物的萃取流程,實現待測物的直接提取,縮短流程、節省時間,但目前應用還未得到推廣。五、cyp1a2活性眾所周知,許多CYP450s酶均參與了咖啡因體內的生物轉換。因為咖啡因是人類生活中廣泛接觸的外源物質,用咖啡因代謝指數評估體內藥物代謝酶活性的研究近年來引發人們極大的興趣。尿液中咖啡因代謝產物的比率(CMRs)常用于藥物代謝酶活性的評估,包括CYP1A2、CYP2A6、N-乙酰轉移酶、黃嘌呤氧化酶。咖啡因是CYP1A2經典的探藥,因為幾乎90%的咖啡因由CYP1A2轉化代謝。血尿中咖啡因代謝比率(17U+17X)/137X、17X/137X和(AFMU+1X)/17U及(AAMU+1X+1U)/17U常用于CYP1A2活性的評價(Nakajima等.1994,Lang等.1994)。(AFMU+1X+1U)/17U這一指標不受尿流量的影響,主要建立在咖啡因代謝終產物的比率上,因而尿液標本的采集量和時間對CYP1A2活性的評價影響不大。AFMU/1X、AFMU/(AFMU+1X+1U)、(AAMU+AFMU)/(AAMU+AFMU+1X+1U)常用于NAT2的活性評價(Bendriss等.2000);17U/17X、17U/(AFMU+1X+1U+17X+17U)常用于CYP2A6活性的評價;1U/(